單細(xì)胞多組學(xué)揭示阿爾茨海默癥的單核染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組特征

單細(xì)胞多組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，特別是同時(shí)研究細(xì)胞染色質(zhì)開放性和基因表達(dá)特征，本次給大家推薦的是單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)在阿爾茨海默癥中的應(yīng)用。
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發(fā)表期刊：Nature Genetics

影響因子：38.3307

發(fā)表日期：2021-08

摘要

在健康和疾病中，大腦的基因調(diào)控是高度動態(tài)的，協(xié)調(diào)著不同細(xì)胞類型之間一系列生物過程。本文展示了一項(xiàng)針對來自晚期阿爾茨海默癥(AD)患者191890個(gè)細(xì)胞核的多組學(xué)單細(xì)胞核研究。分析了相同生物樣本中的染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)，揭示了細(xì)胞異質(zhì)性。鑒定了細(xì)胞類型特異性、疾病相關(guān)的候選順式調(diào)控元件及其候選靶基因，包括一個(gè)與APOE和CLU連接的少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)調(diào)控模式。闡述了由全基因組關(guān)聯(lián)研究的AD風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)上特定細(xì)胞類型的順式調(diào)控關(guān)系，證明了多組學(xué)單細(xì)胞核方法的實(shí)用性。神經(jīng)膠質(zhì)群體的軌跡分析確定了疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如SREBF1及其調(diào)控靶基因。最后，作者還進(jìn)行了單核共識加權(quán)基因共表達(dá)分析，這是一種對稀疏單細(xì)胞數(shù)據(jù)穩(wěn)定的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析策略，并對AD轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了系統(tǒng)分析。

實(shí)驗(yàn)方法

RNA-seq、snRNA-seq、snATAC-seq、FISH、免疫熒光

背景介紹

人腦由多個(gè)不同種類的細(xì)胞組成，神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞協(xié)同工作，完成簡單而高階的任務(wù)。最近的研究已經(jīng)提供了認(rèn)知正常大腦中神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞群體的更√確的分子特征和識別。然而，對疾病大腦中的異質(zhì)細(xì)胞群體的了解仍然很有限，這限制了對疾病背后的生物學(xué)過程的理解。神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥(AD)，其特點(diǎn)是大量神經(jīng)元丟失，并伴有膠質(zhì)細(xì)胞增生，而特定的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞群在AD病理生理學(xué)中的作用尚不清楚。目前僅在小鼠和人類組織上進(jìn)行了幾項(xiàng)單細(xì)胞和單細(xì)胞核RNA測序(snRNA-seq)研究，揭示細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄變化，但這些疾病相關(guān)細(xì)胞亞型的調(diào)控因素尚未確定。

此外，已經(jīng)對阿爾茨海默癥進(jìn)對阿爾茨海默等復(fù)雜疾病的GWAS研究表明，從常見變異到遠(yuǎn)端調(diào)控元件的遺傳風(fēng)險(xiǎn)占很大比例。這些調(diào)控元件通常是疾病相關(guān)組織中特定細(xì)胞類型的區(qū)域。雖然在將GWAS信號與功能基因組學(xué)分析(包括批量RNA-seq和高通量測序分析轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)分析(ATAC-seq))交叉方面進(jìn)行了大量工作，但此類研究的分辨率明顯受到細(xì)胞類型異質(zhì)性的限制。將GWAS HITS與細(xì)胞類型聯(lián)系起來的一個(gè)先決條件是將遠(yuǎn)端調(diào)控元件與它們的靶基因聯(lián)系起來。

ATAC-seq是檢測組織內(nèi)開放的染色質(zhì)區(qū)域。迄今為止，單細(xì)胞染色質(zhì)可及性技術(shù)，如單核ATAC-seq (snATAC-seq)，很少用于疾病組織的原始樣本，因此，研究人員對同一AD患者死后的腦組織樣本同時(shí)進(jìn)行了snATAC-seq和snRNA-seq，以在表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組水平揭示AD相關(guān)基因調(diào)控程序，并為研究大腦的細(xì)胞異質(zhì)性提供了一個(gè)新方法，并且能夠揭示特定細(xì)胞群中神經(jīng)退化的新途徑。
本文對191890個(gè)來自阿爾茨海默癥患者死后腦組織和認(rèn)知健康對照的細(xì)胞核進(jìn)行了單細(xì)胞核多組學(xué)分析，通過整合snRNA-seq和snATAC-seq數(shù)據(jù)，從而對阿爾茨海默癥分子層面變化更完善的理解。通過染色質(zhì)可及性分析確定了細(xì)胞類型特異性的候選順式調(diào)節(jié)元件(cCREs)，并發(fā)現(xiàn)了疾病相關(guān)的細(xì)胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄組變化。確定了可能調(diào)節(jié)阿爾茨海默癥基因表達(dá)變化的轉(zhuǎn)錄因子。此外，在整合的數(shù)據(jù)上進(jìn)行了偽時(shí)間軌跡分析。然后將候選的阿爾茨海默癥風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的精細(xì)定位的GWAS信號與snATAC-seq數(shù)據(jù)整合，將阿爾茨海默癥風(fēng)險(xiǎn)信號與它們可接近的特定細(xì)胞類型聯(lián)系起來，并確定了這些位點(diǎn)的順式調(diào)控染色質(zhì)可接近網(wǎng)絡(luò)。此外，由于網(wǎng)絡(luò)分析在闡明組織水平RNA-seq數(shù)據(jù)中的疾病轉(zhuǎn)錄組特征方面是有效的，研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析通路，整合了單細(xì)胞和批量RNA-seq數(shù)據(jù)，在每種細(xì)胞類型中識別了AD相關(guān)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)果

一、人類前額葉皮質(zhì)的多組學(xué)分析

研究者進(jìn)行了snATAC-seq (10×Genomics；12例晚期AD、8例對照)和snRNA-seq (10×Genomics v3；11例晚期AD、7例對照組)，使用從晚期AD患者和年齡匹配的認(rèn)知健康對照組(74-90歲以上；圖1a)。根據(jù)Braak分期和斑塊分期定義了晚期AD和對照。從同一組織樣本分別生成轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，以減少兩種方法之間的細(xì)胞類型組成差異。經(jīng)過質(zhì)控過濾后，對130418個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行snATAC-seq，61472個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行snRNA-seq。為了保證研究的嚴(yán)謹(jǐn)性，對這兩種方法的數(shù)據(jù)采用了批量校正。對于snATAC-seq，使用了相互最近鄰(MNN)來校正潛在的semantic indexing來降低的染色質(zhì)可達(dá)性；對于snRNA-seq，使用了整合非負(fù)矩陣因子分解(iNMF)來降維，同時(shí)消除批次效應(yīng)。將UMAP降維和Leiden聚類應(yīng)用到批量校正的表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，在snATAC-seq和snRNA-seq中識別到了不同的細(xì)胞類型(圖1b、c)。利用snATAC-seq，分析了腦的所有主要細(xì)胞類型——興奮性神經(jīng)元(24076個(gè)細(xì)胞核，EX.a-e)、抑制神經(jīng)元(9644個(gè)細(xì)胞核，INH.a-d)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(15399個(gè)細(xì)胞核，ASC.a-f)、小膠質(zhì)細(xì)胞(12232個(gè)細(xì)胞核，MG.a-e)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(62253個(gè)細(xì)胞核，ODC.a-m)和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(4869個(gè)細(xì)胞核；OPC.a)，基于已知標(biāo)記基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)可及性進(jìn)行注釋。同時(shí)使用chromVAR通過估算可訪問染色質(zhì)區(qū)域的TF結(jié)合基序的富集來計(jì)算單細(xì)胞核內(nèi)TF基序的變異性，并檢測了依據(jù)細(xì)胞類型劃分的TF基序的富集情況，確定了在星形膠質(zhì)細(xì)胞、興奮性神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中隨著疾病發(fā)生而富集增加的幾種TF基序。此外，對TF足跡進(jìn)行分析，以進(jìn)一步闡明細(xì)胞類型特異性TF調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX9 TF足跡在少突膠質(zhì)細(xì)胞中的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)在興奮性神經(jīng)元中TF motif富集了少突細(xì)胞相關(guān)的TF。同樣，使用snRNA-seq-檢測到了類似的細(xì)胞類型——興奮性神經(jīng)元(6369個(gè)細(xì)胞核，EX1-5)、抑制神經(jīng)元(5962個(gè)細(xì)胞核，INH1-4)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(4756個(gè)細(xì)胞核，ASC1-4)、小膠質(zhì)細(xì)胞(4126個(gè)細(xì)胞核，MG1-3)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(37052個(gè)細(xì)胞核，ODC1-13)和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(2740個(gè)細(xì)胞核，OPC1-2)，通過細(xì)胞類型標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行分類(圖1e)。在這兩種檢測中，少突膠質(zhì)細(xì)胞都是常見的細(xì)胞類型。此外，雖然每種主要細(xì)胞類型中的許多差異表達(dá)基因(DEGs)與以前的文獻(xiàn)一致，但也發(fā)現(xiàn)先前被確定為神經(jīng)元或膠質(zhì)亞型標(biāo)記的細(xì)胞分群特異性基因。

由于表觀基因組圖譜與下游基因表達(dá)信號深度交織在一起，研究人員使用了Seurat的整合平臺整合了snATAC-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)(圖1f)。在整合的UMAP空間時(shí)將染色質(zhì)數(shù)據(jù)或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獨(dú)立分類的細(xì)胞類型整合在了一起(圖1g)。在snATAC-seq和snRNA-seq中使用相同的生物樣本，導(dǎo)致來自這兩個(gè)數(shù)據(jù)模擬動態(tài)的細(xì)胞核在共同構(gòu)建的空間中高度重疊。

圖1單核ATAC-seq和單核RNA-seq在研究病變腦細(xì)胞多樣性中的應(yīng)用

二、阿爾茨海默癥中細(xì)胞異質(zhì)性的多組學(xué)特征

在snATAC-seq和snRNA-seq中，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞亞群，并基于之前鑒定的標(biāo)記基因?qū)nRNA-seq中的亞群進(jìn)行了注釋(圖2)。對于snATAC-seq聚類，研究人員使用的是Seurat的標(biāo)記轉(zhuǎn)移算法來計(jì)算聚類預(yù)測值。研究人員對疾病組的每個(gè)分群的組成進(jìn)行分析，與對照相比在AD晚期中發(fā)現(xiàn)了一些明顯的過高或過低組分(圖2d-g)，并且在兩種數(shù)據(jù)中結(jié)果類似。ASC3 (GFAPhigh/CHI3L+) 隨疾病程度比例顯著增加，而ASC4 (GFAPlow/WIF1+/ ADAMTS17+) 顯著降低。這與最近對患AD的小鼠5XFAD模型的snRNA-seq研究一致。研究人員還發(fā)現(xiàn)MG.a和MG.b在AD晚期增加，兩者都定位到激活的snRNA-seq聚類的MG1 (SPP1high/CD163+)，且隨疾病的加重而增加。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)免疫少突膠質(zhì)細(xì)胞簇ODC13在AD晚期顯著增加。

圖2.人類AD前額葉皮質(zhì)中不同的表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄差異細(xì)胞亞群

三、晚期阿爾茨海默癥的細(xì)胞類型特異性順式基因調(diào)控

基于研究人員在同一樣本中同時(shí)使用snATAC-seq和snRNA-seq的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究人員推測可以在特定的細(xì)胞群體中確定cCREs的靶基因。為此，研究人員通過在每一種細(xì)胞類型中分別為AD晚期和對照樣本構(gòu)建順式共可及網(wǎng)絡(luò)(CCANs)來闡明AD晚期PFC的順式調(diào)控結(jié)構(gòu)。

為了識別cCREs的靶基因，研究人員將重點(diǎn)放在了共可及peaks上，選定其中位于啟動子元件中的peaks，得到了一組cCREs和候選靶基因。研究人員將候選靶基因的表達(dá)與cCRE的染色質(zhì)可及性關(guān)聯(lián)起來，旨在研究潛在調(diào)控關(guān)系的，而不僅僅是共可及性。最后，研究人員使用NMF根據(jù)這些基因連鎖的cCRE(gl-cCRE)在每個(gè)細(xì)胞分群中的染色質(zhì)可及性進(jìn)行分析和聚類?？偠灾?，對于晚期AD和對照樣本中的每一種主要細(xì)胞類型，這種方法導(dǎo)致了一組候選增強(qiáng)子元件(gl-cCRE)以及一組cCRE連鎖的基因被分組到功能模塊中。

總的來說，使用這種方法共鑒定了56552個(gè)gl-cCREs和11440個(gè)cCREs連鎖基因，每個(gè)基因的中位數(shù)為4個(gè)cCREs(圖3a)。通過檢查在每個(gè)細(xì)胞類型中鑒定的cCREs連鎖基因組之間的重疊，研究人員發(fā)現(xiàn)，除了那些細(xì)胞類型特異性的基因外，還有大量具有連鎖cCRE的基因在多種細(xì)胞類型中共享(圖3b)。在一些細(xì)胞類型中，研究人員發(fā)現(xiàn)cCREs連鎖基因與細(xì)胞類型標(biāo)記DEGs以及該細(xì)胞類型中在AD中上調(diào)的基因之間存在顯著重疊，這表明cCREs在疾病相關(guān)基因表達(dá)變化中發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖3c)。研究人員還研究了這些gl-cCREs的每個(gè)snATAC-seq分群的染色質(zhì)可及性，并發(fā)現(xiàn)到細(xì)胞類型和分群高度特異性(圖3d)。大部分gl-cCREs定位于內(nèi)含子區(qū)域(58.35%；圖3e)。此外，通過檢查NMF系數(shù)矩陣(H)，研究人員能夠識別每個(gè)NMF模塊對應(yīng)的分群或細(xì)胞類型，并注釋了幾個(gè)特定于控制晚期AD細(xì)胞核的模塊(圖3f、g)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)一些在多種細(xì)胞類型中共有的cCRE靶基因在每種細(xì)胞類型中受不同的cCRE調(diào)控。

 

圖3.將順式調(diào)控元件連接到特定細(xì)胞類型中的下游靶基因

 

四、晚期阿爾茨海默癥中的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子

為了補(bǔ)充對順式調(diào)節(jié)元件的分析，研究人員在晚期AD中識別了特定細(xì)胞類型的反式調(diào)節(jié)元件。TFs在神經(jīng)發(fā)育過程中嚴(yán)格控制細(xì)胞命運(yùn)，并與神經(jīng)退化過程有關(guān)。研究人員分析了小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移因子SPI1(也稱為PU.1)和核呼吸因子1(NRF1)在少突膠質(zhì)細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用(圖4a-f)。snATAC-seq小膠質(zhì)細(xì)胞分群中的SPI1基序可變性只在上調(diào)的MG.a和MG.b中顯著增加，但SPI1的靶基因在只有MG1中顯著下調(diào)(圖4a、b)。研究人員還發(fā)現(xiàn)NRF1在特定的少突膠質(zhì)細(xì)胞分群中表達(dá)失調(diào)(圖4d-f)。這些結(jié)果表明，SPI1在晚期AD中起轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用。此外，NRF1已被認(rèn)為與線粒體功能相關(guān)，NRF1調(diào)節(jié)失調(diào)所介導(dǎo)的線粒體功能受損可能通過破壞髓鞘形成而導(dǎo)致晚期AD的神經(jīng)元功能障礙。

為了進(jìn)一步探究晚期AD中TF介導(dǎo)的基因調(diào)控，研究人員構(gòu)建了特定細(xì)胞類型的TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對于特定的TF，研究人員確定了候選目標(biāo)基因，即其啟動子或連鎖的cCRE是可訪問的，并且在目標(biāo)細(xì)胞類型中包含TF的結(jié)合基序的基因，研究人員對幾個(gè)選定的TF重復(fù)了這一過程，產(chǎn)生了小膠質(zhì)細(xì)胞特異性和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性的TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖4g，h)。在這些網(wǎng)絡(luò)中，研究人員發(fā)現(xiàn)了多個(gè)AD DEGs，除了位于已知AD GWAS位點(diǎn)的基因外，還受到小膠質(zhì)細(xì)胞中的SPI1和少突膠質(zhì)細(xì)胞中的NRF1的調(diào)控。

 

圖4. AD晚期中細(xì)胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控

 

五、疾病相關(guān)膠質(zhì)細(xì)胞的綜合軌跡分析

為了進(jìn)一步揭示阿爾茨海默癥膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性的分子機(jī)制，研究人員使用Monocle3進(jìn)行了偽時(shí)間軌跡分析。在少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中整合的snATAC-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)。多組軌跡分析能夠研究在細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的連續(xù)體中基因表達(dá)、染色質(zhì)可及性和TF基序可變性的動態(tài)。研究人員使用遞歸變異自動編碼器(RVAE)對基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性動態(tài)進(jìn)行建模。對于每種細(xì)胞類型，研究人員確定了沿著軌跡差異表達(dá)的基因(t-DEGs)。

六、少突膠質(zhì)細(xì)胞軌跡顯示SREBF1失調(diào)

研究人員使用snATAC-seq的58221個(gè)細(xì)胞核和snRNA-seq的36773個(gè)細(xì)胞核構(gòu)建了一個(gè)完整的少突膠質(zhì)細(xì)胞軌跡(圖5a)，發(fā)現(xiàn)AD晚期樣本的細(xì)胞核比例似乎沿著軌跡增加(圖5b)。為了闡明與晚期AD相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)，研究人員檢測了新形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞(NF-ODCs)、髓鞘形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞(MF-ODCs)和成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖5c)。研究人員發(fā)現(xiàn)成熟ODC基因表達(dá)特征在軌跡的末端增加，而MF-ODC基因表達(dá)特征減少。此外，NF-ODC基因標(biāo)記在整個(gè)軌跡中全部降低，這表明少突膠質(zhì)細(xì)胞偽時(shí)間軌跡再現(xiàn)了少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟過程。9231個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞gl-cCREs的染色質(zhì)可及性和1563個(gè)用RVAE重建的少突膠質(zhì)細(xì)胞t-DEGs的基因表達(dá)表明，大量的染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄重編程可能是少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟的基礎(chǔ)(圖5d)。

此外，RVAE得到的潛伏特征空間提供了對疾病中的偽時(shí)間軌跡和基因調(diào)控的進(jìn)一步生物學(xué)觀察(圖5e)。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單一的特征(基因或染色質(zhì)區(qū)域)。研究人員根據(jù)每個(gè)功能在軌跡上達(dá)到*大值75%的位置對其進(jìn)行排名，研究人員稱之為該功能的“軌跡排名”。然后，研究人員將重建特征軌跡(如圖5d)與晚期AD細(xì)胞核的比例進(jìn)行對比(如圖5b)，查看哪些特征與AD持續(xù)變化。對于基因(t-DEGs)和染色質(zhì)區(qū)域(gl-cCREs)，潛在空間明確地將與晚期AD細(xì)胞核比例正或負(fù)相關(guān)的特征分組在一起，并將具有相似軌跡等級的特征分組在一起，這表明了該RVAE模型在分析和解釋多組偽偽時(shí)間動力學(xué)方面的是可行的。

少突膠質(zhì)細(xì)胞中的兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子：NRF1和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)。SREBF1在調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有人認(rèn)為Aβ可以抑制SREBF1的激活。研究人員發(fā)現(xiàn)，在晚期AD的少突膠質(zhì)細(xì)胞中，NRF1基序可變性上調(diào)(圖4d)，而SREBF1基序可變性隨疾病的發(fā)生而下調(diào)。研究人員將TF基序可變性軌跡與重構(gòu)的t-DEG表達(dá)軌跡相關(guān)聯(lián)，并可視化了TF與2D潛在空間內(nèi)每個(gè)基因之間的相關(guān)性，確定了由TF結(jié)合激活或抑制的候選靶基因(分別為正或負(fù)軌跡相關(guān)性；圖5f)。發(fā)現(xiàn)NRF1與軌跡末端的靶基因呈負(fù)相關(guān)，而SREBF1與軌跡開始和末端的靶基因呈正相關(guān)，表明SREBF1在整個(gè)軌跡中起著轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。

 

圖5.多染色體少突膠質(zhì)細(xì)胞軌跡分析

 

?七、小膠質(zhì)細(xì)胞軌跡定義疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞

對少突膠質(zhì)細(xì)胞軌跡分析使用相同的分析方法，對snATAC-seq的10768個(gè)核和snRNA-seq的4119個(gè)細(xì)胞核構(gòu)建了一個(gè)完整的小膠質(zhì)細(xì)胞軌跡(圖6a)。晚期AD樣本的細(xì)胞核比例在整個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞軌跡中顯著增加(圖6b)。疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAM)的基因特征進(jìn)行了分析。DAM是AD相關(guān)的吞噬小膠質(zhì)細(xì)胞，在TREM2依賴和TREM2依賴的階段依次激活。
整合小膠質(zhì)細(xì)胞的軌跡伴隨著穩(wěn)態(tài)特征的減少，階段1的DAM特征的增加和階段2依賴于TREM2的DAM特征的明顯的耗損(圖6c)，表明這種小膠質(zhì)細(xì)胞軌跡從穩(wěn)態(tài)到疾病相關(guān)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化。

為了進(jìn)一步剖析小膠質(zhì)細(xì)胞的軌跡，再次用RVAE(圖6d、e)分別對9163個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞gl-cCRE和2138個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞t-DEG的染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)動態(tài)進(jìn)行了建模。對ETS家族轉(zhuǎn)錄因子——SPI1和ETS變體5(ETV5)進(jìn)行分析，這兩個(gè)家族在AD晚期都顯示出基序可變性以及候選靶基因的上調(diào)(圖6f)。還觀察到SPI1基序軌跡與軌跡末端的基因呈負(fù)相關(guān)，即SPI1在晚期AD中起到抑制因子的作用。

八、人類阿爾茨海默癥中與疾病相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞

利用snATAC-seq的12112個(gè)細(xì)胞核和snRNA-seq的4704個(gè)細(xì)胞核構(gòu)建了一個(gè)完整的星形膠質(zhì)細(xì)胞軌跡(圖6h)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)AD晚期細(xì)胞核的比例在整個(gè)軌跡中顯著增加(圖6h)。與小膠質(zhì)細(xì)胞軌跡中的DAM信號的分析結(jié)果類似。研究人員研究了疾病相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞(DAAs)的基因信號，基于DAA基因特征分析，推斷這一軌跡遵循從GFAP低態(tài)到GFAP高態(tài)與DAA狀態(tài)的趨勢相似(圖6i)。
12487個(gè)星形細(xì)胞gl-cCRE和1797個(gè)星形細(xì)胞t-DEG的RVAE模型顯示了整個(gè)軌跡中富集的基因調(diào)控動力學(xué)(圖6j、k)。研究人員對星形膠質(zhì)細(xì)胞t-DEGs與兩種轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了研究：CCCTC-binding factor (CTCF)和FOSL2，發(fā)現(xiàn)這兩種因子的基序變異性在AD晚期分別下調(diào)和上調(diào)。CTCF被認(rèn)為是一個(gè)主要的染色質(zhì)調(diào)控因子，研究發(fā)現(xiàn)CTCF基序可變性軌跡與DAA和GFAPhigh信號呈負(fù)相關(guān)，而與該軌跡GFAP-low的t-DEGs呈正相關(guān)(圖6l)。另外研究人員發(fā)現(xiàn)FOSL2的基序變異軌跡與GFAP-high和DAA基因信號呈正相關(guān)，并與軌跡末端的基因呈正相關(guān)(圖6l)。這些發(fā)現(xiàn)表明FOSL2可能是DAA信號的激活因子，而CTCF可能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞處于進(jìn)穩(wěn)態(tài)或非病變星形膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)。通過將基因表達(dá)與TF基序富集、TF結(jié)合位點(diǎn)可及性聯(lián)系起來，以及利用RVAE得到的時(shí)間信息，揭示了TF在調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)(如DAA)中的作用。

圖6.多染色體小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞軌跡分析

九、細(xì)胞類型特異性順式調(diào)控在阿爾茨海默癥遺傳風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)

為了進(jìn)一步探究AD遺傳風(fēng)險(xiǎn)信號，研究人員使用AD和其他相關(guān)性狀的GWAS匯總統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，對snATAC-seq聚類進(jìn)行細(xì)胞類型特異性連鎖不平衡評分回歸分析(LDSC)。Kunkle等人的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞MG.b和MG.c對AD GWAS SNPs有顯著的富集作用，Jansen等人的研究中5個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞簇均顯著富集(MG.a、MG.e、MGb、MG.c和MG.d)，其中除了來自AD患者的數(shù)據(jù)外，還包括家族性AD-by-proxy樣本(圖7a)。GWAS遺傳分析的結(jié)果支持了之前在非患病人類和小鼠中的snATAC-seq數(shù)據(jù)。研究人員沿著小膠質(zhì)細(xì)胞的偽時(shí)間軌跡進(jìn)行了研究，觀察到整個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞軌跡遠(yuǎn)端peaks的gchrom VAR偏差分?jǐn)?shù)顯著增加(圖7b、c)，這與類似基因-近端peaks分析的偏差分?jǐn)?shù)顯著下降形成鮮明對比，這表明DAM中遠(yuǎn)端增強(qiáng)子上具有與AD相關(guān)的SNPs。通過將共可及性圖與染色質(zhì)可及性信號和沿基因組軸的GWAS統(tǒng)計(jì)疊加，研究人員揭開了GWAS基因中被致病變異破壞的潛在順式調(diào)控關(guān)系，如BIN1、ADAM10、APOE和SLC24A4(圖7d-i)。研究人員發(fā)現(xiàn)APOE基因座是研究AD遺傳性的主要決定因素，也是目前研究得詳細(xì)的AD風(fēng)險(xiǎn)基因座之一，其在疾病中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中具有順式調(diào)控染色質(zhì)網(wǎng)絡(luò)改變的作用。

圖7.阿爾茨海默癥患者腦內(nèi)GWAS基因座的細(xì)胞類型特異性調(diào)控格局

十、scWGNCA的單細(xì)胞共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

為了將snRNA-seq數(shù)據(jù)在系統(tǒng)框架中重新定義，研究人員開發(fā)了一種加權(quán)基因共表達(dá)分析(WGCNA)的單細(xì)胞數(shù)據(jù)的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析方法，WGCNA是一種用于識別疾病相關(guān)基因模塊的強(qiáng)大分析方法，最初是為批量基因表達(dá)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的。研究人員對其進(jìn)行了修訂，其中“meta-cells”是通過使用特定細(xì)胞群體中k-nearest neighbors計(jì)算50個(gè)相鄰細(xì)胞的平均表達(dá)來構(gòu)建的。Mathys等人發(fā)表的的AD snRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新處理，并使用iNMF將這些數(shù)據(jù)與其snRNA-seq數(shù)據(jù)整合。此外，研究人員對早期和晚期AD樣本以及對照樣本進(jìn)行了批量RNA-seq。最后，研究人員使用WGCNA對不同時(shí)期的人類PFC的snRNA-seq數(shù)據(jù)和批量RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建的meta-cells聯(lián)合形成了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

研究人員對少突膠質(zhì)細(xì)胞的scWGCNA分析進(jìn)行了重點(diǎn)研究，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)與AD診斷顯著相關(guān)的共表達(dá)模塊——OM1、OM2、OM4和OM5(圖8a、b)。例如，AD下調(diào)模塊OM1的hub基因編碼核糖體亞基(例如，RPS15A、RPL30和RPL23A)，與它對蛋白質(zhì)合成和分選相關(guān)GO富集一致。已知OM2基因成員MAG、CNP和PLP1參與髓鞘形成，研究人員發(fā)現(xiàn)OM2隨著疾病的發(fā)生而下調(diào)。
此外，研究人員在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中檢查了SREBF1的下游調(diào)控靶基因。隨后又發(fā)現(xiàn)其中三個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞顯著富集了SREBF1的靶基因，這表明SREBF1在調(diào)節(jié)這些模塊中的基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用(圖8c)。將批量RNA-seq、高通量蛋白質(zhì)組學(xué)、SREBF1-ChIP)以及ChIP-seq的數(shù)據(jù)確定了SREBF1靶基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)SREBF1靶基因模塊的基因表達(dá)量在AD早期和晚期樣本的蛋白和RNA中下調(diào)(圖8d)，證實(shí)snATAC-seq SREBF1基序的可變性。通過RNA原位雜交和免疫組織化學(xué)方法驗(yàn)證了SREBF1在晚期AD中的下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)ACSL4的表達(dá)在晚期AD中有所降低，ACSL4是ENCODE Chip-Seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的SREBF1的靶點(diǎn)之一 (圖8e-g)?？傮w而言，研究人員的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析方法有助于識別細(xì)胞類型特異性疾病，在少突膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TF SREBF1，這在AD中基本上沒有研究過，表明其研究方法能夠?qū)膊‘a(chǎn)生新的見解。

圖8.批量和單細(xì)胞共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析揭示的基因表達(dá)模塊

討論

對晚期阿爾茨海默癥的綜合多組學(xué)分析為了解疾病發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)獨(dú)特的視角，揭示了疾病發(fā)病機(jī)制下細(xì)胞異質(zhì)性的連續(xù)性?！檀_定位復(fù)雜疾病的致病機(jī)制需要在表觀基因組和轉(zhuǎn)錄水平上對細(xì)胞群體特異性基因調(diào)控系統(tǒng)有深入的理解。雖然單細(xì)胞染色質(zhì)的可及性可以提供對疾病的重要見解，但由于其固有的稀疏性，研究人員通過整合相同樣本的單核開放染色質(zhì)和單核轉(zhuǎn)錄組，以及使用聚類進(jìn)行批量可及性分析和共可及性分析，避免了稀疏性問題?？紤]到這些因素，多組學(xué)分析能夠分析神經(jīng)退行性病變中特定細(xì)胞類型的表觀基因組失調(diào)，破譯了人類AD中單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組。
研究人員發(fā)現(xiàn)了特定細(xì)胞類型的gl-cCRE，它可能介導(dǎo)晚期AD的基因調(diào)控，也可能與特定細(xì)胞類型中的gl-cCRE的TF結(jié)合。雖然cCRE可以僅用表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)來鑒定，但他們的分析是通過整合單核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來證實(shí)的，因?yàn)檠芯咳藛T將候選靶基因的基因表達(dá)與CCRE染色質(zhì)的可及性聯(lián)系起來。之前對AD的研究還沒有探索細(xì)胞類型或細(xì)胞亞群水平的順式基因調(diào)控。研究人員強(qiáng)調(diào)了晚期AD中順式基因和反式基因調(diào)控的紊亂，為進(jìn)一步研究AD提供了潛在的靶點(diǎn)，如少突膠質(zhì)細(xì)胞中的NRF1和星形膠質(zhì)細(xì)胞及其相應(yīng)的gl-cCRE中的FOSL2。此外，研究人員檢查了多組學(xué)數(shù)據(jù)中的順式調(diào)控相互作用，以闡明GWAS與遺傳性AD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的細(xì)胞類型和疾病特異性基因表達(dá)模式。研究人員比較了AD和對照細(xì)胞群體之間的順式調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，確定了在疾病中唯一的相互作用。因此，這項(xiàng)研究為更廣泛的AD研究提供了一個(gè)資源，未來可以探索感興趣的基因和基因組區(qū)域的細(xì)胞類型以及細(xì)胞狀態(tài)特異性調(diào)控圖譜。

此外，對少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)圖譜的獨(dú)立和聯(lián)合分析顯示，AD的基因調(diào)控和生物學(xué)途徑受到干擾。研究人員分析了一個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞的軌跡，并評估了新形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中的基因表達(dá)特征，觀察到該軌跡似乎與少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟的發(fā)育方向一致。研究人員還發(fā)現(xiàn)在晚期AD中SREBF1基序的變異性降低，表明疾病中可與SREBF1結(jié)合的位點(diǎn)減少，而且SREBF1基因在AD少突膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)也下調(diào)。軌跡分析表明，SREBF1基序的可變性與整個(gè)軌跡中的t-DEGs呈正相關(guān)，表明它在少突膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。

共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析方法（如WGCNA）已被廣泛應(yīng)用于海量基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的疾病相關(guān)基因的研究，然而，這些方法很少用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)，本文研究人員開發(fā)了scWGCNA，它利用聚集的meta-cells來減弱單細(xì)胞基因表達(dá)的稀疏性。研究人員利用scWGCNA聯(lián)合分析了snRNA-seq和批量RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了人類AD中的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。scWGCNA鑒定了三個(gè)SREBF1富集靶基因的少突膠質(zhì)細(xì)胞模塊，并表明這些靶基因和蛋白的表達(dá)在AD晚期降低。通過對少突膠質(zhì)細(xì)胞中SREBF1的共表達(dá)和軌跡分析，SREBF1顯然是一個(gè)后續(xù)具有重要研究價(jià)值的基因，作為AD治療的候選靶點(diǎn)，也證明了研究人員的分析方法在確定新疾病基因靶點(diǎn)方面的實(shí)用性。

雖然散發(fā)性阿爾茨海默癥的致病分子機(jī)制仍不清楚，但研究人員的研究成果提供了新的見解，有助于揭示阿爾茨海默癥基因調(diào)控的本質(zhì)。但還需要解決阿爾茨海默癥和神經(jīng)退行性變中基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的復(fù)雜性的問題。這里提供的數(shù)據(jù)是理解疾病大腦中調(diào)節(jié)關(guān)系的寶貴資源，其分析的框架為挖掘單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)、發(fā)現(xiàn)復(fù)雜特征提供了藍(lán)圖。

 

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