三代微生物多樣性是基于?PacBio 測(cè)序平臺(tái),利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(SMRT Cell)的方法對(duì) marker 基因進(jìn)行測(cè)序,之后通過(guò)對(duì) CCS(Circular Consensus Sequencing)序列過(guò)濾,得到 Optimization-CCS 進(jìn)行 OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類,并進(jìn)行物種注釋及豐度分析,可以揭示樣品的物種構(gòu)成; 進(jìn)一步進(jìn)行α多樣性分析(Alpha Diversity)、β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異分析等等,可以挖掘?樣品之間的差異。
目前,微生物多樣性研究主要是于編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進(jìn)行的。細(xì)菌主要是基于16S區(qū),真菌主要基于18S區(qū)或ITS區(qū)(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)),16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的DNA序列,18S rDNA是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA(18S rRNA)的DNA序列,ITS是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列。這些序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū),保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系,而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異。由于18S rDNA在進(jìn)化速率上比較保守,在系統(tǒng)發(fā)育研究中較適用于種級(jí)以上階元的分類。常用作微生物分類研究的ITS分為ITS1和ITS2兩種。ITS1位于真核生物核糖體rDNA序列的18S和5.8S之間,ITS2位于真核生物核糖體rDNA序列5.8S和28S之間。由于ITS區(qū)在核糖體RNA加工過(guò)程中被剪切掉,不發(fā)揮功能作用,在進(jìn)化過(guò)程中選擇壓力較小,進(jìn)化速率約為18S rDNA的10倍,屬于中度保守的區(qū)域,利用它可研究種及種以下的分類階元。另外,也可通過(guò)選擇引物同時(shí)擴(kuò)增18S rDNA和ITS,通過(guò)分析18S rDNA序列,先在較高級(jí)別上確定樣品的歸屬,然后根據(jù)ITS 序列,將真菌歸類到種或亞種水平。
我們對(duì)不同類型的樣品如:土壤、糞便、腸道、水體等,隨機(jī)挑選了30個(gè)項(xiàng)目對(duì)其進(jìn)行物種注釋率進(jìn)行研發(fā)優(yōu)化,目前采用優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)及注釋方法的策略,將其種水平平均注釋率提升到60%+。二代注釋到屬和種的平均比例為78%和6%,相同樣品采用三代進(jìn)行注釋時(shí),屬和種水平平均注釋率為95%和60%,注釋結(jié)果提升非常明顯。


測(cè)序數(shù)據(jù)量飽和度
基于PacBio SMRT單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)可以對(duì)DNA序列實(shí)現(xiàn)單分子級(jí)別的超長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序,能夠輕易實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境樣品中rDNA/ITS/功能基因進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序,不受制于短序列的局限性,提供了種甚至菌株水平的物種分辨率,更全面的解釋物種的多樣性。
統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示:?jiǎn)螛颖?000條CCS即可達(dá)到飽和。
建庫(kù)測(cè)序:
提取樣品總 DNA 后,根據(jù) 16S 全長(zhǎng)引物 27F 和 1492R(及其他全長(zhǎng)引物),合成帶有 Barcode 的特異引物,進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)(SMRT Bell),建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢,質(zhì)檢合格的文庫(kù)用 PacBio Sequel 進(jìn)行測(cè)序。PacBio Sequel下機(jī)數(shù)據(jù)為 bam 格式,通過(guò) smrtlink 分析軟件導(dǎo)出 CCS 文件, 根據(jù) Barcode 序列識(shí)別不同樣品的數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)化為 fastq 格式數(shù)據(jù)。
生信流程:
數(shù)據(jù)預(yù)處理:將 PacBio 下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出為 CCS 文件( CCS 序列使用 Pacbio 提供的 smrtlink 工具獲取)后,主要有如下3個(gè)步驟:
1)CCS識(shí)別:使用?lima v1.7.0軟件,通過(guò)barcode對(duì)CCS進(jìn)行識(shí)別,得到的Barcode-CCS序列數(shù)據(jù);
2)CCS長(zhǎng)度過(guò)濾:使用百邁客公司自主研發(fā)的軟件,對(duì)Barcode-CCS進(jìn)行過(guò)濾,得到有效序列;
3)去除嵌合體:使用?UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到 Optimization-CCS 序 列。
信息分析內(nèi)容:劃分OTU、多樣性及差異性分析(具體見(jiàn)分析結(jié)果)。
| 環(huán)境樣品 | 送樣要求 | 保存及運(yùn)輸 |
| 普通土壤 | 除去土壤表層未分解的凋落物層、動(dòng)植物殘?bào)w、石礫等雜質(zhì),將大塊的樣品搗碎,過(guò)2mm篩后,分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中;每管土壤含量大概0.25~0.5g,需保證送樣量在1~2g。 |
樣本-80℃或液氮中長(zhǎng)期保存,干冰運(yùn)輸 |
| 根際土壤 | 收集植物植株,去除根部大塊土壤;搖動(dòng)植株去除附著不緊密的土壤,使用無(wú)菌刷子收集根部附著緊密的土壤;隨機(jī)多點(diǎn)取樣5-10g,過(guò)2mm篩后,分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中;每管土壤含量大概0.25~0.5g,需保證送樣量在1~2g。 | |
| 糞便 | 無(wú)菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段內(nèi)部(避免表層中的腸道膜脫落細(xì)胞),外部容易污染且細(xì)菌DNA由于接觸空氣可能有降解。將已取的糞便樣品分裝至2mL?EP管(無(wú)菌)或凍存管(無(wú)菌)中,每管糞便量為0.5~2g,每個(gè)樣品分裝2~3管備份。 | |
| 腸道內(nèi)容物 | 在實(shí)驗(yàn)對(duì)象死亡后,無(wú)菌條件下,取出整個(gè)腸道,用無(wú)菌解剖刀切取所需腸段的,用無(wú)菌手術(shù)刀挖取內(nèi)容物分裝至2mL?EP管(無(wú)菌)或凍存管(無(wú)菌)中,每管組織量為0.5~2g,每個(gè)樣品分裝2~3管備份 | |
| 水體 | 過(guò)濾大量低微生物含量的清亮水樣用0.22μm?的聚苯醚砜濾膜,每個(gè)樣本至少1L水樣。渾濁水樣使用0.22μm濾膜過(guò)濾緩慢容易堵塞時(shí),建議使用0.45μm的混合纖維素酯濾膜,每個(gè)樣本0.5L-1L水樣;如果水樣中不可溶解的顆粒較多,需要使用2-5μm孔徑的濾膜將不可溶解的顆粒雜質(zhì)濾去,再使用0.22μm或0.45μm的濾膜富集菌體,每個(gè)樣本0.5L-1L水樣。 | |
| 空氣 | 開(kāi)動(dòng)采樣儀(浮游細(xì)菌采集器),使被測(cè)空氣濾過(guò)凝膠膜(滅菌),空氣中的浮游菌被截留在凝膠膜上(過(guò)濾時(shí)間越長(zhǎng),收集的空氣中的灰塵越多,菌數(shù)量越多),收集完成后取下濾膜。 |
|
項(xiàng)目類型 |
濃度 |
總量 |
純度 |
完整性 |
|
微生物多樣性 |
≥10ng/μL(Qubit) |
≥500ng |
擴(kuò)增條帶正常 |
主帶清晰,無(wú)降解或輕度降解 |
| 內(nèi)容 | 項(xiàng)目 | 引物名稱 | 序列 | 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 |
| 全長(zhǎng) | 16S 全長(zhǎng) | 27F | 5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′ | 1.5K |
| 1492R | 5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′ | 1.5K | ||
| 18S全長(zhǎng) | EukA | 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′ | 1.8K | |
| EukB | 5′-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′ | 1.8K | ||
| ITS 全長(zhǎng) | ITS1 | 5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ | 0.6-0.7K | |
| ITS4 | 5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ | 0.6-0.7K |
案例一:
Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning
發(fā)表時(shí)間:2020
合作單位:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
發(fā)表期刊: Journal of Hazardous Materials
研究背景:戊唑醇?xì)⒕鷦┦且环N應(yīng)用廣泛的殺菌劑,對(duì)水生生物和人類健康具有潛在威脅。微生物降解農(nóng)藥是一種高效、低成本和環(huán)境友好的方法。本研究假設(shè)生物炭可能是降解戊唑醇細(xì)菌的理想載體,而固定化生物炭比自由施用的細(xì)菌可能加速戊唑醇從土壤中的去除。為了驗(yàn)證這一點(diǎn),我們以麥秸源生物炭為載體,利用戊唑醇降解菌WZ-2對(duì)污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)。
測(cè)序策略: Pacbio SequelII 全長(zhǎng)16S測(cè)序
研究結(jié)論:菌株WZ-2和固定化生物炭的WZ-2加速了戊唑的降解,使戊唑在土壤中的半衰期分別從40.8天降低到18.7天和13.3天。雖然戊唑醇對(duì)土壤酶活性(脲酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)化酶)和微生物群落結(jié)構(gòu)有負(fù)面影響,但固定化生物炭的WZ-2不僅加速了戊唑醇的降解,而且恢復(fù)了土壤微生物酶活性和微生物群落組成。
參考文獻(xiàn): Sun T, Miao J, Saleem M, Zhang H, Yang Y, Zhang Q. Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning.?J Hazard Mater. 2020


案例二:
Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks
發(fā)表時(shí)間:2021
合作單位:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
發(fā)表期刊: Science of the Total Environment
研究背景:砷是一種重要的有害金屬,普遍存在于受污染的土壤、河流和地下水中。然而,關(guān)于三氧化二砷(ATO,砒霜)對(duì)水禽腸-肝軸的影響及其肝毒性的研究還很少。本研究探討了腸-肝軸在三氧化二砷誘導(dǎo)的肝毒性和腸道毒性中的作用。
測(cè)序策略:Pacbio SequelII 全長(zhǎng)16S
測(cè)序 研究結(jié)論: ATO暴露可引起鴨腸道菌群α-多樣性顯著降低, 對(duì)照組中凸腹真桿菌、產(chǎn)硫球鏈菌、類腸膜魏斯氏菌和厭氧消化鏈球菌等更豐富。ATO暴露顯著降低腸道屏障相關(guān)蛋白的表達(dá),導(dǎo)致腸道通透性增加和脂多糖水平升高;上調(diào)了肝臟和空腸的焦亡相關(guān)指數(shù),并增加了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明,ATO誘導(dǎo)的肝臟和空腸炎癥是由LPS/TLR4/NF-κB信號(hào)通路和NLRP3炎癥小體的激活引起的。這些結(jié)果表明,ATO暴露可導(dǎo)致肝臟和空腸炎癥和焦亡,而間接的腸-肝軸通路可能在ATO誘導(dǎo)肝毒性的潛在機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
參考文獻(xiàn): Zhong G, Wan F, Lan J, et al. Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks.?Sci Total Environ. 2021

| 樣本類型 | 年份 | 期刊 | IF | 合作單位 | 題目 |
|---|---|---|---|---|---|
| 土壤 | 2020 | Journal of Hazardous Materials | 10.588 | 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) | Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning |
| 牛瘤胃 | 2020 | Frontiers in microbiology | 5.64 | 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) | Fermented Soybean Meal Replacement in the Diet of Lactating Holstein Dairy Cows: Modulated Rumen Fermentation and Ruminal Microflora |
| 雞腸道 | 2021 | Science of the Total Environment | 6.551 | 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) | Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks |
| 土壤 | 2021 | Frontiers in Microbiology | 5.64 | 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) | Influence of Peanut, Sorghum, and Soil Salinity on Microbial Community Composition in Interspecific Interaction Zone |
| 青貯發(fā)酵 | 2021 | Frontiers in Microbiology | 5.64 | 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) | Fermented Soybean Meal Replacement in the Diet of Lactating Holstein Dairy Cows: Modulated Rumen Fermentation and Ruminal Microflora |
| 青貯發(fā)酵 | 2021 | Food and Energy Security | 5.21 | 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) | Microorganisms that are critical for the fermentation quality of paper mulberry silage |
| 小鼠盲腸內(nèi)容物 | 2021 | Ecotoxicology and Environmental Safety | 6.291 | 首都醫(yī)科大學(xué) | Characterization of gut microbiota, metabolism and cytokines in benzene-induced hematopoietic damage |
| 小鼠腸道 | 2021 | Food & Function | 5.396 | 福建師范大學(xué) | Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model |
| 腸道 | 2021 | Journal of Hazardous Materials | 10.588 | 成都生物研究所 | Animal gut microbiome mediates the effects of antibiotic pollution on an artificial freshwater system |
全長(zhǎng)微生物多樣性最主要優(yōu)勢(shì)為種水平注釋率高,三代測(cè)序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多多個(gè)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序,能夠更為準(zhǔn)確的還原群落結(jié)構(gòu)。
收到您的樣本后跟進(jìn)項(xiàng)目類型進(jìn)行提取擴(kuò)增,建庫(kù)測(cè)序到數(shù)據(jù)分析,交付原始數(shù)據(jù)和結(jié)題報(bào)告,售后服務(wù)。
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