宏基因組（NGS）
快！準！性價比高！
宏基因組技術(shù)介紹
宏基因測序是通過高通量測序技術(shù)對環(huán)境樣品中全部微小生物遺傳物質(zhì)，包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因組進行測序分析，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。
產(chǎn)品熱點
無需分離培養(yǎng)，可鑒定環(huán)境樣品中物種組成和功能組成；
分辨率高，可檢測環(huán)境樣品中極低豐度物種；
可獲得環(huán)境樣品中全面的功能基因信息,涵蓋碳氮磷硫代謝、抗性基因等；
可組裝獲得環(huán)境中單菌基因組信息 ；
實驗設(shè)計到信息分析一站式服務(wù)
提供全面的宏基因組研究的方案設(shè)計和售后服務(wù)，豐富的標準分析以及個性化分析多角度闡明環(huán)境微生物潛在的功能和作用機制。
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方案確定
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提取檢測
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建庫測序
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信息分析
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售后服務(wù)
分析內(nèi)容
技術(shù)策略與送樣要求
?測序策略：NovaSeq PE150
DNA送樣要求：DNA濃度≥1ng/ul（Qubit），DNA質(zhì)量≥30μg（Qubit），DNA電泳條帶清晰，無降解或者輕度降解。
| 環(huán)境樣品 | 送樣要求 | 保存及運輸 |
| 普通土壤 | 除去土壤表層未分解的凋落物層、動植物殘體、石礫等雜質(zhì)，將大塊的樣品搗碎，過2mm篩后，分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保證送樣量在1~2g。 | 樣本-80℃或液氮中長期保存，干冰運輸 |
| 根際土壤 | 收集植物植株，去除根部大塊土壤；搖動植株去除附著不緊密的土壤，使用無菌刷子收集根部附著緊密的土壤；隨機多點取樣5-10g，過2mm篩后，分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保證送樣量在1~2g。 | |
| 糞便 | 無菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段內(nèi)部（避免表層中的腸道膜脫落細胞），外部容易污染且細菌DNA由于接觸空氣可能有降解。將已取的糞便樣品分裝至2mL?EP管（無菌）或凍存管（無菌）中，每管糞便量為0.5~2g，每個樣品分裝2~3管備份。 | |
| 腸道內(nèi)容物 | 在實驗對象死亡后，無菌條件下，取出整個腸道，用無菌解剖刀切取所需腸段的，用無菌手術(shù)刀挖取內(nèi)容物分裝至2mL?EP管（無菌）或凍存管（無菌）中，每管組織量為0.5~2g，每個樣品分裝2~3管備份 | |
| 水體 | 過濾大量低微生物含量的清亮水樣用0.22μm?的聚苯醚砜濾膜，每個樣本至少1L水樣。渾濁水樣使用0.22μm濾膜過濾緩慢容易堵塞時，建議使用0.45μm的混合纖維素酯濾膜，每個樣本0.5L-1L水樣；如果水樣中不可溶解的顆粒較多，需要使用2-5μm孔徑的濾膜將不可溶解的顆粒雜質(zhì)濾去，再使用0.22μm或0.45μm的濾膜富集菌體，每個樣本0.5L-1L水樣。 | |
| 空氣 | 開動采樣儀（浮游細菌采集器），使被測空氣濾過凝膠膜（滅菌），空氣中的浮游菌被截留在凝膠膜上（過濾時間越長，收集的空氣中的灰塵越多，菌數(shù)量越多），收集完成后取下濾膜。 |
產(chǎn)品優(yōu)勢與項目經(jīng)驗
豐富的項目經(jīng)驗與專業(yè)的信息團隊，提供全面準確的信息分析。
高水平分析團隊
豐富的項目經(jīng)驗
全面的分析內(nèi)容
專業(yè)的售后服務(wù)
成功案例
物種注釋
使用diamond軟件將質(zhì)控后的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)比對到 nr數(shù)據(jù)庫，得到樣品的物種組成和相對豐度信息。
物種組成的主成分分析
主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)是一種分析和簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，通過將方差進行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸取能夠最大反映方差 的兩個特征值。通過分析不同樣品物種組成可以反映樣品間的差異和距離。PCA圖上兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品中物種的組成越相似。使用R語言工具分別繪制不同分類水平PCA分析圖
物種進化分析
基于樣品物種組成信息，使用軟件MetaPhlAn2繪制物種進化分枝圖，可以展示樣品所含物種的系統(tǒng)進化信息。
微生物基因功能注釋
將預(yù)測到的非冗余基因與Nr、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對，獲得基因功能注釋信息，了解環(huán)境中微生物潛在的生物學功能。
CAZy 數(shù)據(jù)庫功能注釋
CAZy是碳水化合物酶相關(guān)的專業(yè)數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容包括能催化碳水化合物降解、修飾、以及生物合成的相關(guān)酶系家族。
CARD功能基因組成分析
在注釋時，使用CARD數(shù)據(jù)庫中的工具軟件rgi將非冗余基因的蛋白序列分別數(shù)據(jù)庫進行比對，找出比對上的數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)序列，并得到對應(yīng)的抗性基因和抗性相關(guān)信息。
差異基因功能富集分析
通過比較不同環(huán)境下微生物基因的豐度，尋找不同環(huán)境下存在的差異基因并對這些差異基因做功能富集分析，研究微生物對不同環(huán)境的響應(yīng)機制。
功能基因組間差異
使用Welch’s t-test進行組間差異參數(shù)檢驗；如果超過兩組，使用ANOVA分析進行組間差異參數(shù)檢驗。通過參數(shù)檢驗獲得的不同功能基因水平的豐度熱圖
案例一
Prevalence of antibiotic resistance genes and bacterial pathogens along the soil-mangrove root continuum
發(fā)表時間：2021
合作單位：中山大學
發(fā)表期刊： Journal of Hazardous Materials
研究背景：植物的根往往被土壤細菌所侵染，這些細菌被認為是抗生素抗性基因(ARGs)的主要接納體。ARGs可以在這些微生物和病原體之間轉(zhuǎn)移，但這些ARGs和病原體在多大程度上從土壤傳播到植物的機制還不清楚。本研究使用擴增子和宏基因組測序研究了紅樹林幼樹土壤4個與根系相關(guān)的空間，揭示病原菌可能沿土壤-根系連續(xù)體傳播的途徑。
測序策略： 16S V3+V4 Illumina Hiseq 2500 PE250 + 宏基因組 Illumina PE150
研究結(jié)論： 91.4%的ARGs在4個與根系相關(guān)的空間共享，與微生物區(qū)隔選擇動力學不同，導入-以一種連續(xù)的方式散布在土壤-根系連續(xù)體上。這種傳播與潛在的根系相關(guān)的細菌和真菌微生物群無關(guān)，但可能是由多種可移動遺傳元素促進的。創(chuàng)傷弧菌、致病性大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌作為多藥耐藥病原菌，在4個隔室中均占主導地位，表明抗生素病原菌可能沿土壤-根系連續(xù)體傳播 。
參考文獻： Wang C, Hu R, Strong PJ, et al. Prevalence of antibiotic resistance genes and bacterial pathogens along the soil-mangrove root continuum.?J Hazard Mater. 2021
土壤-根系界面
土壤-根系連續(xù)體中抗生素抗性菌群和微生物群落的動態(tài)
案例二
Synergistic interactions of Desulfovibrio and Petrimonas for sulfate-reduction coupling polycyclic aromatic hydrocarbon degradation
發(fā)表時間：2021
合作單位：廣東省微生物研究所
發(fā)表期刊： Journal of Hazardous Materials
研究背景：隨著工業(yè)化和城市化進程的推進，多環(huán)芳烴類污染物在水體沉積物中頻繁檢出，給水生態(tài)安全和人類健康造成極大威脅。本研究通過結(jié)合梯度稀釋培養(yǎng)法、傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)以及宏基因組這這下學分析等多種方法手段，深入解析了黑臭河流沉積物中硫酸鹽呼吸耦合多環(huán)芳烴降解的核心功能微生物組。
測序策略：宏基因組 Illumina PE150
研究結(jié)論：梯度稀釋培養(yǎng)法在顯著降低沉積物中微生物群落復(fù)雜同時，并未削弱菌群的多環(huán)芳烴降解功能。Desulfovibrio和Petrimonas是硫酸鹽呼吸耦合多環(huán)芳烴降解的核心功能微生物。這兩種微生物通過潛在的協(xié)同作用促進多環(huán)芳烴降解轉(zhuǎn)化。其中，Desulfovibrio主要負責通過羧化途徑將多環(huán)芳烴降解至六氫-2-萘甲酰，而Petrimonas則利用其相對完整的三羧酸循環(huán)途徑和磷酸戊糖途徑實現(xiàn)前者多環(huán)芳烴中間代謝產(chǎn)物的進一步降解轉(zhuǎn)化。
參考文獻： Qian Y, Xu M, Deng T, et al. Synergistic interactions of Desulfovibrio and Petrimonas for sulfate-reduction coupling polycyclic aromatic hydrocarbon degradation.?J Hazard Mater. 2021
實驗流程
屬水平物種相關(guān)性分析
Q1.宏基因組與微生物多樣性的區(qū)別？
宏基因組將基因組DNA隨機打斷成若干條小片段，然后在片段兩端加通用引物進行PCR擴增測序，將得到的reads進行組裝后進行基因預(yù)測得到基因序列，眾多基因構(gòu)成環(huán)境中微生物的基因集
微生物多樣性主要針對核糖體小亞基基因序列進行測序（16s rDNA或者18s rDNA），該基因既存在高度保守的區(qū)域還包括高變區(qū)，通過特異性引物對某一段高變區(qū)（如V3區(qū)）或某幾段高變區(qū)（如V3-V4區(qū)）進行擴增測序，然后與數(shù)據(jù)庫比對，可特異性識別細菌種類。總的來說，微生物多樣性主要告訴我們環(huán)境里有什么微生物，而宏基因組主要告訴我們環(huán)境里的微生物能做什么。
Q2.為什么宏基因組與微生物多樣性物種注釋結(jié)果存在差異？
微生物多樣性和宏基因組都會分析環(huán)境中物種的種類，但是物種的豐度在二者之間存在一定的差異，第一種原因是微生物多樣性是基于核糖體小亞基基因序列進行物種注釋和豐度統(tǒng)計，但是在不同物種中核糖體基因的拷貝數(shù)不一樣，這會帶來一些誤差；第二種原因是二者在建庫測序過程中會進行PCR反應(yīng)，在PCR這個過程中也會存在一些誤差。
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