2025年4月2日，Industrial Crops & Products在線發(fā)表了由四川省林草局、四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王婧教授課題組聯(lián)合中南林業(yè)科技大學(xué)等多家單位合作完成的研究論文，題為” Phylogenomic analysis and SNP fingerprinting construction of Camellia oleifera Abel. germplasm resources using SLAF-seq technology”。該研究利用SLAF-seq技術(shù)，對(duì)四川省主栽的來自我國(guó)南方25個(gè)主要油茶品種開展了系統(tǒng)發(fā)育和群體基因組學(xué)研究，并篩選關(guān)鍵SNP標(biāo)記構(gòu)建了DNA指紋圖譜。該指紋圖譜的構(gòu)建有望為我國(guó)南方尤其是四川地區(qū)油茶種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)利用及品種選育提供關(guān)鍵科學(xué)依據(jù)。
百邁客生物為該研究提供了SLAF-seq測(cè)序分析服務(wù)。
研究背景
油茶（Camellia oleifera Abel.）是我國(guó)重要的木本油料作物之一，以其高含油量與豐富的不飽和脂肪酸而享有“東方橄欖油”的美譽(yù)。我國(guó)已有超過2000年的油茶栽培歷史，并具有約4500萬畝的種植面積。油茶不僅具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更具重要生態(tài)功能。其廣泛分布于我國(guó)南方多個(gè)氣候生態(tài)帶，是研究森林生態(tài)適應(yīng)性與基因資源保護(hù)的重要對(duì)象。然而，當(dāng)前油茶品種識(shí)別主要依賴形態(tài)學(xué)方法，容易造成品種混淆、資源管理混亂和知識(shí)產(chǎn)權(quán)糾紛等一系列問題，難以滿足現(xiàn)代林業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與良種選育的需求。為推動(dòng)油茶良種選育，產(chǎn)業(yè)升級(jí)和響應(yīng)國(guó)家森林四庫(kù)相關(guān)文件的精神，需加快構(gòu)建高效、廉價(jià)且準(zhǔn)確的DNA指紋圖譜。
研究結(jié)果
1.用于SLAF測(cè)序的最優(yōu)限制性內(nèi)切酶組合
首先，研究共采集25個(gè)油茶栽培品種，共100個(gè)樣本,利用高通量SLAF-seq建庫(kù)策略進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取。在建庫(kù)酶切方案篩選方面，團(tuán)隊(duì)預(yù)先開展酶切模擬試驗(yàn)比較篩選最優(yōu)組合，F(xiàn)igure 1 顯示，RsaI + HaeIII組合在標(biāo)簽分布均勻性、多態(tài)性與文庫(kù)復(fù)雜度上表現(xiàn)最佳。共獲得362,152個(gè)高質(zhì)量SLAF 標(biāo)簽，其中254,357個(gè)為多態(tài)性標(biāo)簽，平均GC含量41.30%，平均Q30高達(dá)93.44%，顯示測(cè)序數(shù)據(jù)具備極高的可靠性。RsaI + HaeIII雙酶切組合可實(shí)現(xiàn)高效的特異性位點(diǎn)擴(kuò)增與標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)化，為后續(xù)大規(guī)模SNP檢測(cè)奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
2.基因組變異特征分析
經(jīng)測(cè)序，每個(gè)樣本平均測(cè)序深度為13.95×，共鑒定出470,397個(gè)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，并初步檢測(cè)到36,317,329個(gè)SNP位點(diǎn)，經(jīng)過質(zhì)控過濾后，最終保留了5,685,673個(gè)高質(zhì)量SNP供后續(xù)分析。這些SNP廣泛分布于油茶基因組的各個(gè)染色體區(qū)域，具有較強(qiáng)的代表性和應(yīng)用潛力，為油茶的遺傳多樣性研究和分子育種提供了寶貴的遺傳資源。 Figure 2展示了SNP位點(diǎn)在各染色體上的分布密度、覆蓋深度和變異質(zhì)量參數(shù)，為后續(xù)的遺傳結(jié)構(gòu)分析及品種識(shí)別提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。
3.各油茶品種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系
為了系統(tǒng)闡明25個(gè)油茶品種之間的親緣關(guān)系與遺傳結(jié)構(gòu)，研究結(jié)合了鄰接法（NJ樹）、主成分分析（PCA）與群體結(jié)構(gòu)分析（ADMIXTURE）三種方法，進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育與群體結(jié)構(gòu)分析（Figure 3）。NJ樹的結(jié)果顯示，大多數(shù)樣本能夠根據(jù)其品種進(jìn)行合理聚類，呈現(xiàn)出明顯的系統(tǒng)發(fā)育規(guī)律。然而，部分品種則呈現(xiàn)出混合的聚類模式，具體包括華碩HS與華鑫HX、湘林XL-3與湘林XL-210、以及湘林XL-1與長(zhǎng)林CL-4。而達(dá)林DL-22品種的個(gè)體聚類較為分散且無序，表現(xiàn)出較為復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)。在PCA分析中，前兩個(gè)主成分（PC1和PC2）解釋了大部分遺傳變異（PC1和PC2分別占11.20%和8.89%），并顯示出明顯的群體結(jié)構(gòu)分布，這與NJ樹的聚類結(jié)果高度一致。進(jìn)一步的群體結(jié)構(gòu)分析表明，當(dāng)K值為3時(shí)，分析結(jié)果最佳，將品種劃分為三大類群：第一類群包括達(dá)林DL-1、長(zhǎng)林CL-4和湘林XL-1；第二類群包括川榮CR-153、湘林XL-3和湘林XL-210；第三類群則包括其余所有品種。需要注意的是，DL-22品種的個(gè)體表現(xiàn)出較高的遺傳混雜性，這可能與其基因漸滲、引種或雜交歷史相關(guān)。這些分析結(jié)果為進(jìn)一步理解油茶品種的遺傳多樣性、進(jìn)化關(guān)系以及品種改良提供了重要的遺傳信息。
4.遺傳多樣性揭示品種差異
為了全面評(píng)估油茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性，研究統(tǒng)計(jì)了包括雜合度（Heterozygosity）、核苷酸多樣性指數(shù)（π）、單態(tài)位點(diǎn)數(shù)量（Singleton）以及Watterson’s θ值等關(guān)鍵遺傳參數(shù)（Figure 4）。結(jié)果表明，川榮（CR）系列品種（如CR-153、CR-55）在各項(xiàng)遺傳變異指標(biāo)上均表現(xiàn)出較高水平，尤其是核苷酸多樣性指數(shù)（π）顯著高于其他品種。具體而言，singleton在長(zhǎng)林（CL）系列品種（如CL-3、CL-4、CL-40）、翠屏（CP）系列（如CP-16）和江安（JA）系列品種（如JA-54）中較少，而在川榮CR-153和CR-55中則為最多（Figure 4B）。核苷酸多樣性（π）值的差異也較為顯著，川榮品種CR-50、CR-156、CR-55和CR-153的π值明顯高于其他品種，表明川榮系列品種具有較高的遺傳多樣性，可能為油茶品種改良和分子育種提供重要的遺傳資源（Figure 4C）。類似地，Wattersonθ分析進(jìn)一步揭示了品種間分離位點(diǎn)的變化，川榮CR-153、湘林XL-3和CR-55表現(xiàn)出較高的θ值，與singleton的趨勢(shì)一致（Figure 4D）。近交系數(shù)（F）分析結(jié)果與遺傳多樣性模式一致，顯示川榮CR-156、CR-55和CR-447的F值最低，表明其遺傳多樣性較高，而長(zhǎng)林CL系列品種（如CL-3、CL-40、CL-4）的F值較高，反映其遺傳多樣性較低?？傮w而言，遺傳多樣性分析結(jié)果表明，長(zhǎng)林（CL）系列品種由于長(zhǎng)期的人工選育和馴化，遺傳背景較為單一，表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性；而川榮系列品種則保持較高的遺傳多樣性。該研究結(jié)果為篩選核心種質(zhì)資源和制定育種策略提供了有力的遺傳依據(jù)。
5.遺傳分化分析明確親緣結(jié)構(gòu)
通過計(jì)算品種兩兩之間的Fst值與構(gòu)建遺傳距離矩陣，研究進(jìn)一步明確了油茶品種間的遺傳分化程度和親緣關(guān)系（Figure 5）。Fst值的分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)林CL-4、達(dá)林DL-1與湘林XL-1三者之間的Fst值極低（0.0106–0.0110），這表明這些品種可能源自相同或相似的遺傳背景。類似地，川榮CR-153與湘林XL-3、湘林XL-210之間的Fst值也表現(xiàn)出較高的遺傳相似性（0.0036–0.0442），提示這些品種可能具有共同的祖源關(guān)系。相比之下，達(dá)林DL-22與川榮CR-50（0.0816）、川榮CR-55（0.0870）和達(dá)林DL-1（0.0759）之間的Fst值較高，顯示出較為顯著的遺傳分化，反映其與這些品種的親緣關(guān)系較為緊密，但仍保持一定的遺傳獨(dú)特性。其它品種的Fst值范圍從0.1013到0.2908，表明這些品種的遺傳起源更加多樣，可能涉及不同的地理區(qū)域或品種間的較大差異（Figure 5A）。研究人員進(jìn)一步使用GCTA軟件計(jì)算的G矩陣分析，結(jié)果顯示大多數(shù)油茶品種之間的親緣關(guān)系較為明顯，遺傳分化較大（Figure 5B）。然而，一些品種群體的親緣關(guān)系值相似，例如XL-1、CL-4與DL-1；CR-153、XL-3與XL-210；華碩HS與華鑫HX，表明這些品種可能源自相同或相近的祖先背景。與此不同，達(dá)林DL-22品種在其群體內(nèi)部未顯示出顯著的親緣關(guān)系，反映出其群體內(nèi)存在較高的遺傳分化?？傮w而言，這些分析為理解油茶品種的遺傳背景和親緣結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)，揭示了不同品種之間的親緣關(guān)系及其遺傳多樣性。
6.構(gòu)建核心SNP指紋圖譜實(shí)現(xiàn)品種識(shí)別
為建立油茶品種的快速鑒定體系，研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了25個(gè)主栽油茶品種的DNA指紋圖譜（Figure 6）。在初步獲得的234個(gè)候選SNP中，有196個(gè)位點(diǎn)被注釋為功能明確的編碼區(qū)域突變，富集于DNA連接、RNA加工、果糖代謝等重要通路（Figure 6A）。為提升區(qū)分效率，進(jìn)一步篩除掉存在多變異干擾或功能不明的位點(diǎn)，最終篩選得到15個(gè)核心SNP位點(diǎn)，可有效區(qū)分全部25個(gè)油茶品種，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳身份標(biāo)識(shí)。為確保指紋圖譜的準(zhǔn)確性與應(yīng)用價(jià)值，研究通過Sanger測(cè)序?qū)?5個(gè)候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行了引物驗(yàn)證，最終篩選出8個(gè)多態(tài)性強(qiáng)、峰型清晰的核心SNP位點(diǎn)用于構(gòu)建指紋圖譜（Figure 6B）。這些位點(diǎn)主要分布于功能基因區(qū)，涉及次生代謝、胚胎發(fā)育、自噬調(diào)控等關(guān)鍵生物過程，如編碼α-萜品醇合酶的LG12_G02320和控制胚胎發(fā)育與芽形成的FLA8蛋白基因LG03_G02445等，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。為進(jìn)一步提升指紋信息的實(shí)用性，研究人員還開發(fā)了包含8個(gè)位點(diǎn)基因型信息的二維碼系統(tǒng)，其中涵蓋了油脂品質(zhì)、農(nóng)藝性狀及適宜種植區(qū)域等數(shù)據(jù)，為油茶品種的數(shù)字化管理與選育決策提供便捷、高效的技術(shù)支持（Figure 6C）。二維碼系統(tǒng)為油茶品種的數(shù)字化管理與選育決策提供了便捷、高效的技術(shù)支持。通過將分子標(biāo)記信息與油茶生產(chǎn)應(yīng)用相結(jié)合，研究成果不僅實(shí)現(xiàn)了分類識(shí)別功能，還為分子育種提供了重要參考價(jià)值。
總結(jié)
綜上，該DNA指紋圖譜的構(gòu)建為油茶種質(zhì)資源的快速鑒定、精準(zhǔn)管理及產(chǎn)業(yè)化育種提供了高效工具和理論依據(jù)。其開發(fā)的二維碼系統(tǒng)進(jìn)一步推動(dòng)了油茶品種管理的智能化和數(shù)據(jù)化，為我國(guó)油茶資源保護(hù)、優(yōu)質(zhì)品種選育及區(qū)域性產(chǎn)業(yè)布局提供了科學(xué)支持。
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