揚(yáng)州大學(xué)Rugen Xu團(tuán)隊(duì)在《Journal of Experimental Botany》雜志發(fā)表題為“Natural variation and CRISPR/Cas9 gene editing demonstrate the potential for a group VII ethylene response factor HvERF62 in regulating barley (Hordeum vulgare L.) waterlogging tolerance”的論文，揭示了大麥VII類乙烯反應(yīng)因子?HvERF62?通過調(diào)控氣孔形成、活性氧穩(wěn)態(tài)和碳水化合物積累，從而提高大麥耐漬澇能力。
百邁客生物為該研究提供了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。
研究背景
漬澇災(zāi)害是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大威脅之一。隨著氣候變化加劇，極端降水事件日益頻繁，漬澇災(zāi)害對(duì)作物造成的損失也愈發(fā)嚴(yán)重。大麥作為世界第四大谷類作物，對(duì)漬澇脅迫高度敏感。因此，挖掘大麥耐漬澇基因資源，培育耐漬澇新品種，對(duì)于保障糧食安全具有重要意義。
研究結(jié)果
1.全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）鎖定4H染色體上的關(guān)鍵位點(diǎn)
利用包含334份雙棱大麥種質(zhì)資源的自然群體，結(jié)合基因型數(shù)據(jù)和苗期耐漬澇脅迫下的葉綠素含量數(shù)據(jù)，進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）。結(jié)果在4H染色體上檢測(cè)到一個(gè)與葉綠素含量顯著相關(guān)的QTL。在漬澇脅迫下，該QTL不同等位基因間的葉綠素含量存在顯著差異，但在正常條件下差異不明顯（圖1C）?；谶B鎖不平衡衰減距離，確定該QTL的候選基因位于4H染色體上567.5 Mb-576.5 Mb的區(qū)間內(nèi)。
圖1
2.?轉(zhuǎn)錄組分析篩選候選基因?HvERF62
對(duì)3個(gè)耐漬澇材料（Fleet、Tam169、ZW）和3個(gè)漬澇敏感材料（Lian87、Su194、Xiu79）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）分析。通過比較不同材料在正常和漬澇條件下的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在3個(gè)耐漬澇材料中，位于4H染色體QTL區(qū)間內(nèi)的 HvERF62 基因受漬澇脅迫顯著誘導(dǎo)表達(dá)，而在3個(gè)漬澇敏感材料中，該基因表達(dá)量較低（圖3B, 3C）。
3.HvERF62 基因編碼核定位蛋白，屬于VII類乙烯反應(yīng)因子
生物信息學(xué)分析顯示，HvERF62 基因編碼的蛋白具有典型的VII類乙烯反應(yīng)因子（ERFVII）特征，即N端具有保守的MCGGAIL基序（圖3D, 3E）。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明，HvERF62蛋白定位于細(xì)胞核中，符合其轉(zhuǎn)錄因子的功能特征（圖3F）。
圖3
4.CRISPR/Cas9基因編輯創(chuàng)制?HvERF62?突變體
利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，獲得了3個(gè)獨(dú)立的 HvERF62 純合突變體（erf1、erf2、erf3）。這些突變體在正常條件下與野生型（GP）的生長發(fā)育沒有顯著差異。然而，在漬澇脅迫下，突變體的不定根數(shù)量顯著少于野生型，且根長、地上部干重、根干重和葉綠素含量均顯著低于野生型（圖4B-4F）。
圖4
5.HvERF62?通過調(diào)控氣孔形成、ROS穩(wěn)態(tài)和碳水化合物積累影響耐漬澇性
對(duì)野生型和 HvERF62 突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果顯示，在漬澇脅迫下，突變體中有403個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，888個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖5A, 5B）。KEGG富集分析表明，這些差異表達(dá)基因顯著富集在植物-病原互作、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類生物合成、MAPK信號(hào)通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖酵解/糖異生等通路中（圖5C）。
圖5
進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在漬澇脅迫4天后，野生型的不定根中形成了氣孔，而突變體中沒有形成（圖6B, 6D）。同時(shí)，突變體中ADH和PDC活性顯著高于野生型（圖7I, 7J），表明突變體更早進(jìn)入無氧呼吸狀態(tài)。在漬澇脅迫8天后，野生型和突變體都形成了氣孔，但野生型中的氣孔比例更高（圖6C, 6D）。此外，野生型積累了更多的碳水化合物（蔗糖、葡萄糖和淀粉），而突變體中的碳水化合物含量顯著較低（圖7F-7H）。
圖6
細(xì)胞活力染色實(shí)驗(yàn)表明，在漬澇脅迫下，HvERF62 突變體根部的細(xì)胞死亡程度高于野生型（圖8）。ROS熒光染色實(shí)驗(yàn)表明，在漬澇脅迫下，突變體根部積累了更多的ROS（圖9）。此外，突變體中H2O2含量顯著高于野生型，而CAT和GSH活性顯著低于野生型（圖7A-7C）。
圖7
圖8
圖9
6.HvERF62?基因的自然變異與耐漬澇性關(guān)聯(lián)
對(duì)自然群體中 HvERF62 基因的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在43個(gè)SNPs和4個(gè)InDels。根據(jù)這些變異，將種質(zhì)資源分為3個(gè)單倍型（Hap1、Hap2和Hap3）。其中，Hap3由于序列變異導(dǎo)致編碼提前終止。在漬澇脅迫下，Hap1和Hap2的葉綠素含量顯著高于Hap3（圖10A, 10B）。基于InDel變異設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記可用于區(qū)分不同單倍型（圖10C-10E）。
圖10
研究總結(jié)
該研究通過GWAS和轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定到一個(gè)新的大麥耐漬澇基因 HvERF62。該基因編碼一個(gè)VII類乙烯反應(yīng)因子，通過調(diào)控氣孔形成、ROS穩(wěn)態(tài)和碳水化合物積累，從而影響大麥的耐漬澇性。CRISPR/Cas9基因編輯實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 HvERF62 基因的功能。此外，HvERF62 基因的自然變異與大麥耐漬澇性顯著相關(guān)。該研究為大麥耐漬澇分子育種提供了新的基因資源和分子標(biāo)記，加深了對(duì)大麥響應(yīng)漬澇脅迫分子機(jī)制的理解。未來，可進(jìn)一步研究 HvERF62 基因在不同遺傳背景下的耐漬澇效應(yīng)，以及與其他耐漬澇基因的互作關(guān)系，為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、耐漬澇的大麥新品種提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
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