文獻解讀 | 單細胞轉(zhuǎn)錄組助力人猴嵌合體研究

百邁客單細胞測序

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）是在單細胞水平進行高通量基因表達譜檢測，對復(fù)雜細胞群深入分析，表征單個細胞的表達譜，避免單個細胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細胞的均質(zhì)化覆蓋。

導(dǎo)讀

用人多能干細胞（hPSC）形成種間嵌合體已成為在體內(nèi)評估hPSC多能性的有效方案，并且可能在再生醫(yī)學(xué)，包括移植器官和組織再生中發(fā)揮重要作用。使用小鼠和豬胚胎的研究表明，hPSCs并不能有力地促進與人類進化距離較遠的物種的嵌合體形成。本研究主要是在體外培養(yǎng)的食蟹猴（Macaca fascicularis）胚胎中研究人擴展多能干細胞（hEPSC）的嵌合能力，證明hEPSCs能夠在食蟹猴胚胎中存活、增殖，并繪制植入前后細胞圖譜。同時還發(fā)現(xiàn)了種間細胞相互作用，這些事件可能有助于塑造嵌合胚胎內(nèi)人類和食蟹猴細胞的獨特發(fā)育軌跡。本研究結(jié)果可能有助于更好地了解早期人類胚胎發(fā)育和靈長類動物進化，并制定策略以改善進化距離較遠的物種的人類嵌合體的形成。

實驗方法

材料：注入tdTomato+ hEPS細胞的食蟹猴早期囊胚

方法：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

研究結(jié)果

1、體外人猴嵌合囊胚的形成

為確定非人靈長類動物中hPSC的嵌合能力，本研究使用了通過細胞重編程產(chǎn)生的特征明確的hEPSC系iPS1-EPSC，它在小鼠胚胎第10.5天（E10.5）表現(xiàn)出優(yōu)于其他hPSC的嵌合性。與之前的報告一致，iPS1-EPSCs表現(xiàn)出圓頂形集落形態(tài)，并表達核心多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG和SOX2（圖 S1A）。為了生成人猴嵌合胚胎，對食蟹猴的早期囊胚（受精后 6 天 [d.p.f.6]）注射了25個用tdTomato（TD）標(biāo)記的iPS1-EPSC，注射的胚胎培養(yǎng)到晚期囊胚階段（d.p.f.7）進行分析，發(fā)現(xiàn)食蟹猴囊胚內(nèi)hEPSC的增殖很明顯?？偟膩碚f，在所有d.p.f.7的食蟹猴囊胚中檢測到TD+ iPS1-EPSCs（100%，n = 132）（圖 S1B）。

圖S1 宿主食蟹猴胚胎中hEPSCs的譜系規(guī)范

2、人猴嵌合胚胎的轉(zhuǎn)錄圖譜

為進一步描繪人猴嵌合胚胎的發(fā)育軌跡，進行了scRNA-seq以分析不同發(fā)育階段的人和猴細胞的轉(zhuǎn)錄組。胚胎分離后，使用熒光顯微鏡手動收集單個人類（TD+）和猴（TD-）細胞并進行scRNA-seq。對離體培養(yǎng)過程中不同時間點從嵌合胚胎中分離的227個人的和302個食蟹猴的細胞進行了測序（d.p.f.9-d.p.f.17）。TD表達和比對到人類或食蟹猴基因組的reads用于進一步確認每個細胞的來源物種（圖 S2A 和 S2B）。嚴(yán)格過濾后，200 個人的和 272 個食蟹猴的細胞用于進一步分析。每個細胞平均檢測到 9,798 個基因（每百萬轉(zhuǎn)錄本【TPM】>0）和27,936,953條reads，在人和猴細胞之間檢測到的基因數(shù)量和reads沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖 S2C）。為進行比較，本分析中還選擇了已發(fā)表的食蟹猴和人類胚胎細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)集。為避免不同數(shù)據(jù)集的批次影響，本研究使用“錨定”方法去除批次效應(yīng)（圖 S2C）。

圖S2 細胞物種來源鑒定和QC

對scRNA-seq數(shù)據(jù)進行了t-SNE分析，確定了所有樣本（嵌合胚胎和對照胚胎）中存在4個主要細胞cluster：EPI、HYP、TE和EXMC（圖 1A、1B和S2D）。通過細胞特異性marker分析，發(fā)現(xiàn)人和食蟹猴之間存在保守性（圖 S2E）。嵌合胚胎中這些細胞類型的存在表明宿主胚胎的發(fā)育基本上不受注射的hEPSCs的影響。系統(tǒng)發(fā)育樹分析（基于基因表達水平）顯示，雖然嵌合胚胎中的大多數(shù)食蟹猴細胞分離成不同的細胞類型特異性簇（EPI、HYP和TE），但嵌合人類HYP-和TE-like 細胞與 EPI-like 細胞聚集在一起（圖 1C）。因此，嵌合食蟹猴細胞比引入的hEPSC表現(xiàn)出更強的譜系分離。與IF結(jié)果一致，在scRNA-seq數(shù)據(jù)（圖 1A 和 1D）中鑒定到的人類TE-like細胞很少，因此被排除在后續(xù)分析之外。這些結(jié)果表明，hEPSCs在被引入食蟹猴早期囊胚并進行離體胚胎培養(yǎng)后，可以分化為幾種植入前和植入后早期細胞類型。

圖1 人猴嵌合胚胎的單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜

3、hEPSCs在人猴嵌合體發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組動力學(xué)

首先基于所有細胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特性構(gòu)建了一個導(dǎo)向圖（SPRING），所有細胞分為三個分支：EPI、HYP和TE（圖 2A），明確了嵌合體和對照（人和食蟹猴）胚胎之間基因表達模式的相關(guān)性（圖 2B）。當(dāng)嵌合人類細胞與對照人類（0.460）或?qū)φ帐承泛铮?.459）細胞進行比較時，獲得了類似的相關(guān)系數(shù)（圖 2B，右圖），但與對照胚胎相比，嵌合猴細胞的相關(guān)系數(shù)高于嵌合人類細胞（圖 2B，左圖）；接下來發(fā)現(xiàn)嵌合人EPI-like細胞與人胚胎中的EPI細胞相似，而嵌合人HYP和EXMC-like細胞分別與嵌合猴HYP和EXMCs細胞相關(guān)系數(shù)最高（圖 2C）。同時發(fā)現(xiàn)嵌合人類EPI-like細胞逐漸傾向于嵌合猴EPI細胞，R2值從0.363（植入前EPI [Pre_EPI]）增加到0.464（植入后EPI [PostL_EPI]），再增加到0.693（原腸[Gast]細胞）（圖 2C）。以上結(jié)果表明猴胚胎微環(huán)境對人類細胞的基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)產(chǎn)生影響，反之亦然。

由于食蟹猴的細胞在人類細胞存在下表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄組的變化，接下來分析了嵌合胚胎中食蟹猴細胞的發(fā)育動態(tài)。首先確定了嵌合猴胚胎和對照猴胚胎之間的差異表達基因（DEG）。EPI細胞、HYP細胞和EXMCs細胞與對照胚胎相比，嵌合體細胞中分別有424、7和241個基因下調(diào)，5、2和13個基因上調(diào)（圖 2D和S3A）。GO和KEGG富集分析確定了在嵌合猴EPI細胞、HYP細胞和EXMCs細胞中上調(diào)和下調(diào)基因的信號通路，如Hippo和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路分別在嵌合猴EPI細胞和EXMCs細胞中下調(diào)（圖 2E）。

圖2 嵌合胚胎的發(fā)育軌跡

已經(jīng)證明食蟹猴EPI細胞的轉(zhuǎn)錄組譜在嵌合胚胎中發(fā)生了改變，接下來研究了食蟹猴EPI胚胎生態(tài)位是否也受到人類細胞的影響。CellPhoneDB（v2.0.1）可鑒定嵌合胚胎和對照胚胎中EPI和其他譜系（HYP 和 EXMCs）之間細胞的潛在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照胚胎相比，嵌合胚胎中有更多的配體-受體相互作用（如，在猴EPI細胞中檢測到117個 [嵌合] 與10個 [對照] 特異性配體-受體相互作用）（圖 2F 和 S3B）。進行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，嵌合胚胎中被加強的信號通路包括磷脂酰肌醇 3-激酶 [PI3K]-Akt、絲裂原活化蛋白激酶 [MAPK] 信號通路和WNT信號通路（圖 2G）。使用相同的方法，還確定了嵌合胚胎內(nèi)人和猴細胞-細胞的相互作用，如FGF5-FGFR4、NOTCH4-JAG2、WNT2B-FZD4、WISP3-SORL1和PLXNB2- PTN（圖 S3C 和 S3D）。結(jié)果表明，嵌合胚胎內(nèi)的細胞間相互作用得到加強，并可能導(dǎo)致其他信號通路的激活。

圖S3 嵌合胚胎與宿主胚胎食蟹猴細胞對比分析

4、嵌合的人類EPI-like細胞顯示出獨特的發(fā)育軌跡

EPI發(fā)展的特點是進行多能性轉(zhuǎn)變，可能在物種之間表現(xiàn)出不同的動態(tài)。適當(dāng)?shù)腅PI分化對于嵌合體的形成和發(fā)育至關(guān)重要，本研究對嵌合胚胎內(nèi)人類EPI-like細胞的譜系分化進行了研究，并將其與體外培養(yǎng)的人類和食蟹猴胚胎的數(shù)據(jù)集進行了比較，結(jié)果人類EPI-like細胞在植入前、植入后和原腸胚形成階段被鑒定，并且在每個階段表達不同的標(biāo)記物（圖 3A），?；鶊D也顯示了相同的人類EPI-like細胞發(fā)育軌跡。接下來觀察到hEPSCs更類似于早期PostE_EPI和PostL_EPI細胞。嵌合體中人PostL_EPI-like細胞與制備的PSC的相關(guān)性高于naive PSC。為了進一步研究 hEPSC、嵌合體人類 EPI-like細胞和宿主猴EPI細胞的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)，本研究進行了RNA速度和Slingshot分析（圖 3B），結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種不同的RNA速度向量模式：嵌合體人類PostL_EPI-like細胞向量較長，而原腸胚細胞向量較短；宿主猴PostL_EPI細胞缺乏長向量，而原腸細胞具有長向量（圖 3B，左邊兩張圖）。這些結(jié)果表明嵌合人類EPI-like細胞的發(fā)育延遲。Slingshot分析顯示，hEPSCs在注入食蟹猴囊胚后，是從EPSCs到PostL_EPI再到原腸胚的發(fā)育軌跡（圖 3B，右圖）。為了進一步描繪嵌合人類EPI-like細胞的發(fā)育軌跡，將所有與EPI相關(guān)的人類和猴子reads映射到一個共有基因組，并使用先前報道的方法預(yù)測物種之間EPI的發(fā)育軌跡，與RNA速度分析一致，發(fā)現(xiàn)嵌合人類EPI-like細胞比來自宿主猴、對照猴和人類胚胎的EPI細胞分化得更慢（圖 3C）。這些結(jié)果表明，hEPSCs向EPI譜系的特化和/或分化效率低于胚胎細胞。

圖3 食蟹猴胚胎中嵌合人EPI-like細胞的發(fā)育軌跡