繼單細胞轉(zhuǎn)錄組學技術之后，空間轉(zhuǎn)錄組技術登上2020年Nature Methods 年度技術的封面，可以說空間轉(zhuǎn)錄組引領科研領域的主導風向標。
空間轉(zhuǎn)錄組則更是帶來了組織細胞空間信息，提供單細胞分辨率空間轉(zhuǎn)錄組視角，令科學家為之振奮。目前10 visium平臺率先開發(fā)動物冷凍樣本和人FFPE樣本空間轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術，已經(jīng)在人和鼠上有大量的研究報道。然而植物在空間轉(zhuǎn)錄組上研究報道并不多，瑞典斯德哥爾摩皇家理工學院Stefania團隊在Nature Plant（2017）[1] 、Nature Protocols(2018)[2]連續(xù)報道了擬南芥花序、楊樹葉芽、冷杉雌球果在空間轉(zhuǎn)錄組技術上研究，但是植物空間轉(zhuǎn)錄組技術仍然存在太多難題難以突破。
百邁客基于大量的植物組織研究的經(jīng)驗，借助10x visum平臺率先突破了植物空間轉(zhuǎn)錄組應用難題?？梢哉綖閺V大老師提供植物空間轉(zhuǎn)錄組技術服務，讓我們一起來看看植物空間轉(zhuǎn)錄組技術難點和突破。
植物組織冷凍包埋
不同于動物組織的冷凍包埋，植物組織結(jié)構(gòu)上跟動物組織存在很大差異性，特別是植物組織存在較硬的細胞壁以及含水量很高的大液泡等結(jié)構(gòu)，常規(guī)冷凍后的植物組織器官硬度大，形成的冰晶多，從而不易獲得高質(zhì)量的切片。有一些研究報道對關于植物中不同組織器官冰凍切片技術的應用及方法進行了探討，但這些方法大多數(shù)是將植物材料經(jīng)過FAA、多聚甲醛或乙醇等固定液固定、以及一定濃度的甘油處理或液氮速凍等處理后才能得到較好的切片效果，不僅切片條件各異，而且操作過程也較為復雜，對于初學者較難掌握。另外對于切面組織間木質(zhì)化程度差異大、直徑較大且髓部含有較大面積海綿狀細胞的植物組織器官（如甘藍型油菜發(fā)育成熟的主莖）也很難獲得完整的切片。因此需要選擇合適冷凍保護劑處理植物組織，這里推薦利用蔗糖溶液作為冷凍保護液，將植物組織放在合適濃度蔗糖溶液中固定，用對應濃度的蔗糖磷酸緩沖液浸洗，最后抽真空[3]。
圖1. 合蕊柱適合條件(16%蔗糖磷酸緩沖液，切片厚度 10 μm)冷凍切片效果
一般冷凍包埋有三種常見方法：1）直接包埋法，預處理的材料直接用包埋劑（水凝膠/OCT包埋劑）在-20℃冷凍切片機上低溫冷凍處理；2）液氮速凍法：材料經(jīng)常規(guī)方法固定和清洗后 , 先用包埋劑包裹在適當大小的盒內(nèi) , 再用液氮迅速速凍20s,再將樣品放進 － 20 ℃ 速凍 20 ～30 min；3）異戊烷OCT冷凍包埋法：將異戊烷容器置于液氮中冷卻3-5分鐘，直至異戊烷從流動液體狀轉(zhuǎn)為粘稠液體，將包埋盒中材料放在異戊烷，當OCT由透明轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆煌该鞯陌咨珪r，取出包埋盒并放入-80℃冰箱保存。
經(jīng)過蔗糖保護的組織可以通過液氮或者異戊烷冷凍包埋，經(jīng)過處理的包埋塊可以進行切片或者超低溫保存，后續(xù)切片可完整保存植物組織原始的狀態(tài)。植物空間轉(zhuǎn)錄組對于樣本的前期處理非常重要，冷凍包埋的效果是實驗成功的關鍵因素，包埋過程中組織中或者周圍不能產(chǎn)生氣泡，以及處理的樣本要快速進行冷凍包埋。
圖2. 植物組織異戊烷OCT冷凍包埋塊
植物組織冷凍切片
動物組織樣本細胞類型，結(jié)構(gòu)相對比較簡單，切片厚度比較統(tǒng)一，基本上保持在10μm厚度左右。但是植物樣本組織結(jié)構(gòu)復雜，而且木質(zhì)化程度不一，組織相對RNA含量較低，因此植物切片厚度一般根據(jù)樣本類型不同，選擇不同的切片厚度，一般植物冷凍切片厚度范圍為10-50um,根據(jù)物質(zhì)組織類型切片厚度會有所不同，視具體情況而定。
圖3. 植物組織冷凍切片
植物組織冷凍切片染色
動物組織常用HE（蘇木精-伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining )）染色，可以精準識別組織形態(tài)和病理學鑒定。然而植物的組織存在的纖維素和一些木質(zhì)素不適合HE染色方法，采取的是甲苯胺藍染色法，其基本原理是植物組織木質(zhì)化細胞壁呈藍綠色，其他組織成分呈紫藍色，可以精準輔助判斷植物組織形態(tài)學和確定捕獲區(qū)域。
圖4. 百邁客植物組織切片染色數(shù)據(jù)
植物組織優(yōu)化
較大的難點是組織優(yōu)化，由于植物組織結(jié)構(gòu)木質(zhì)化程度不一樣，RNA含量水平偏低，植物組織的RNA透化難度大大加大，要想獲得足夠的RNA，根據(jù)Stefania[2]的方法我們自主優(yōu)化了植物組織透化試劑，使用組合酶的方法，其試劑效果可保證RNA被完全透化下來，解析植物組織空間位置所有RNA表達。
圖5. 植物組織透化酶的選擇參考 Nat Protoc. 2018 Nov;13(11):2425-2446.
植物空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
空間轉(zhuǎn)錄組技術主要解決空間異質(zhì)性的問題，那么該技術在植物領域有哪些應用呢？我們知道植物成長過程中組織不同位置基因表達模式的差異會呈現(xiàn)不同的表型，空間轉(zhuǎn)錄組在植物上提供一種新的視角探討植物組織器官空間基因表達模式，主要可以圍繞生長發(fā)育（育種）、抗逆應激（生物脅迫和非生物脅迫）、免疫反應和致病機理、生物進化等幾個方面研究植物上一些生物學現(xiàn)象和表型，從而提供更高分辨率時空多維度解析科學問題。接下來我們舉幾個實際案例分享植物空間轉(zhuǎn)錄組的應用：
（1）擬南芥花序 植物生長發(fā)育-Natrue Plants,2017[1]
Stefania和 Joakim Lundeberg團隊在2017年就開發(fā)了植物上空間轉(zhuǎn)錄組技術，通過模型被子植物（擬南芥）和裸子植物（楊樹、挪威云杉）的微觀切片生成空間轉(zhuǎn)錄組譜來證明該技術的可行性。該技術捕獲區(qū)域為6.2*6.6mm2，含有1007spot,每個spot的直徑距離是100μm,可以檢測到植物組織在空間維度的所有RNA分子的表達。
文中首先鑒定楊樹休眠期和發(fā)育期葉芽不同組織區(qū)域基因表達特征，證實了技術檢測的z確性、靈敏度以及重復性。休眠期（冬季）和發(fā)育期（夏季）葉芽一共檢測到17043個基因，樣本每個spot檢測到基因中位數(shù)為2929，轉(zhuǎn)錄本檢測中位數(shù)為8061，跟休眠期相比，在發(fā)育期葉芽中有408高表達的基因，在發(fā)育芽還是休眠芽組織切片中，高表達的基因在同一組切片之間和不同組的復制芽切片之間的表達模式清晰一致，無論生物學重復還是技術重復都證實該方法的重顯性和√確性。
圖6. 楊樹休眠芽和發(fā)育芽空間基因表達特征重現(xiàn)性
擬南芥花苞中空間轉(zhuǎn)錄組檢測莖、分生組織、以及3個不同花區(qū)域空間基因表達，一共檢測到20215個基因,鑒定開花有關的兩個關鍵基因At5g57720（已知的在S3和S9表達的基因）和 ATA27 (At1g75940，已知的在S11和S12表達的基因)的√確的空間定位可視化，組織區(qū)域特異性基因和通路的顯著差異，發(fā)現(xiàn)雄蕊絲發(fā)育通路在S11(雄蕊絲伸長的位置)和莖中富集，在莖中維管通道大量存在，并且細胞伸長和維管發(fā)育過程非?；钴S。其中花粉外壁形成途徑在S10和S11發(fā)生改變，在這個階段，外壁是花粉壁的主要組成部分之一，在絨氈層產(chǎn)生并沉積在花粉前細胞上?？臻g基因表達特征揭示了組織區(qū)域異質(zhì)性，并為植物生長發(fā)育過程和相應功能的探索提供了高分辨率的空間植物基因表達模式，從新的維度探索植物發(fā)育過程。
圖7. 擬南芥花序空間基因表達特征
（2）擬南芥花序、楊樹葉芽、冷杉雌球果 植物生長發(fā)育-Nat Protoc, 2018[2]
Stefania和 Joakim Lundeberg團隊2018年繼續(xù)在更多的裸子植物、被子植物轉(zhuǎn)錄組本空間模式探索，提供了不同的植物類型細胞壁采用不同的酶混合物處理方法，以及植物組織冷凍和透化優(yōu)化、組織去除的方法，而擬南芥花序、楊樹葉芽、冷杉雌球果，特別高度異質(zhì)性的組織部位，精準提高了植物空間基因檢測的的特異性（~93%）、z確性（~71%）以及靈敏度（~60%）。
圖8. 擬南芥花序、楊樹葉芽、冷杉雌球果空間基因表達
（3）擬南芥葉片-植物對細菌攻擊的免疫反應途徑 Plant Methods. 2019[4]
Michael Giolai等人利用 GaST-seq技術，檢測擬南芥葉片8個區(qū)域（1mm2）空間基因表達特征，探討解刨誘導的基因應激表達，以及葉片組織空間特異性基因表達，中脈與葉脈差異表達基因393個，葉緣與葉脈差異表達基因有686個；同時細菌分子鞭毛蛋白- flg22感染葉片不同組織區(qū)域，發(fā)現(xiàn)與水處理相比較，不同區(qū)域感染后產(chǎn)生差異表達基因數(shù)目不一樣， flg22誘導后根據(jù)其在葉面積上的空間表達模式√確地聚為36個簇，而且這些基因主要富集在應激和防御反應相關的生物過程，探索植物器官內(nèi)部空間差異和細菌PAMPs的生物刺激所引起的變化的反應機制。
圖9. 擬南芥葉片對病原體的免疫反應空間基因表達特征
（4）挪威云杉雌芽 植物生殖育種 UPPSALA UNIVERSITET, 2020[5]
挪威云杉是瑞典經(jīng)濟的重要出口樹種，它可能需要20-25年的樹木成熟時期。為了培育優(yōu)良品種， Stefania Giacomello and Jens Sundstr?m結(jié)合10x Visium技術進一步研究挪威云杉野生型和早期圓錐形突變體Picea abies var. acrocona的雌性生殖發(fā)育中的空間基因表達模式，該技術捕獲區(qū)域為6.5mm*6.5mm，含有5000個spot,每個spot直徑為55μm,以更高的分辨率鑒定云杉雌芽的空間發(fā)育特征。選取三個類型不同時期挪威云杉（Wildtype, Acrocona or Vegetative；August, September, October）作為研究材料，一共檢測了16個樣本，每個樣本檢測到26000個基因左右，每個spot基因檢出率為525-1855個。
圖10. 挪威云杉雌芽空間轉(zhuǎn)錄組基因表達
UMAP對樣本進行批次效應分析，可視化展示16個樣本空間基因表達聚類可視化圖。
圖11. 挪威云杉雌芽不同樣本聚類可視化
野生型、突變株從8月、9月份、10月份空間差異表達marker基因鑒定，發(fā)現(xiàn)雌芽（F）和營養(yǎng)芽（V）類型之間的生長差異，cluster 1在F和V的9月中表達分布存在差異，主要富集在外部組織區(qū)域，可能是雌性的不育苞片和營養(yǎng)芽中的針部組織。不同組織區(qū)域、不同生長時期云杉葉芽存在組織空間區(qū)域特異性，突變體acrocona空間基因表達的理解可能會加速在野生型P.abies的遺傳實驗，并改善挪威云杉的生長周期，加快優(yōu)良品種的培育。
圖12. 挪威云杉不同區(qū)域marker基因的鑒定分布圖
以上目前植物空間轉(zhuǎn)錄組技術難點和突破點，百邁客已經(jīng)一一攻克這些難點，完成植物在空間實現(xiàn)了高通量測序。
如果對植物空間轉(zhuǎn)錄組感興趣的老師，想要開展相關研究，可以電話咨詢提供植物空間轉(zhuǎn)錄組測序。
欲知更多百邁客植物空間轉(zhuǎn)錄組實測數(shù)據(jù)，盡在下期分享，敬請期待。
參考文獻：
[1] Giacomello S, Salmén F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017 May 8;3:17061.
[2] Giacomello S, Lundeberg J. Preparation of plant tissue to enable Spatial Transcriptomics profiling using barcoded microarrays. Nat Protoc. 2018 Nov;13(11):2425-2446.
[3]陸振芳, 蔣素華, 江敏,等. 蝴蝶蘭花器官冰凍切片技術探討[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報, 2019, 053(002):200-206.
[4] Giolai, M., Verweij, W., Lister, A. et al. Spatially resolved transcriptomics reveals plant host responses to pathogens. Plant Methods 15, 114 (2019).
[5] A spatial analysis of Norwegian spruce cone developmental stages. UPPSALA UNIVERSITET, 2020.
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