2019年7月22日，Nanopore平臺全新測序芯片R10到達百邁客實驗室，百邁客將開啟ONT平臺測序新征程！
近年來，由于三代測序相較于二代測序，擁有單分子無需擴增，長度長等優(yōu)勢，因此在各組學研究中大放異彩。而作為三代測序的代表技術之一，Nanopore平臺因能獲得更長讀長，在基因組學研究中更是備受青睞。但相較于二代平臺，三代平臺測序數(shù)據(jù)的準確性一直是比較大的劣勢。本次Oxford Nanopore Technologies公司即將推出的R10芯片，則劍指準確性。相較于當前廣泛使用的R9.4.1芯片，新型R10芯片可提供相當?shù)淖x長，產(chǎn)量及更準確的數(shù)據(jù)。
R10芯片測序原理
新升級R10芯片大的更新是納米孔采用了雙讀取器（Reader）的設計，能夠?qū)ν粔A基進行兩次信號識別。理論上，同一堿基的識別次數(shù)為R9.4.1版本芯片2倍，由此來增加堿基的判斷率，減小隨機錯誤，并提高一致準確性。R10與R9.4.1測序方式比較如圖1
圖1??測芯片更新前后測序方式比較
01、單reads測序準確性：
目前主流的R9.4.1芯片的表現(xiàn)能力如何？我們隨機抽取了200個已經(jīng)完成常規(guī)ONT DNA測序的樣品（包含各種動植物）進行統(tǒng)計，總共約22.4T數(shù)據(jù)（足夠有代表性了），結(jié)果如下：
可以看到，R9.4.1芯片數(shù)據(jù)的讀長是非常理想的：Reads N50高達到72 Kb，平均達到35 Kb；單分子讀長高達到了1.6 Mb；而關于質(zhì)量值平均為8.3，對應準確性為：85.21%；單個樣品平均質(zhì)量值高達到9.7，對應準確性為：89.28%；
R10的質(zhì)量表現(xiàn)如何呢？我們統(tǒng)計了拿到的四個樣品的數(shù)據(jù)，具體統(tǒng)計結(jié)果見下圖：
圖2 R10數(shù)據(jù)質(zhì)量值分布
絕大部分R10 reads的質(zhì)量值達到了10以上（對應準確性為90.0%），而平均質(zhì)量值為12.1（對應準確性為93.8%），而reads質(zhì)量值已經(jīng)達到了15以上(對應準確性為96.84%)。由此可見，對于單條reads來說，提升還是非常明顯的，平均reads準確性從85%提升到了93.8%。
02、Consensus序列準確：
看完單條reads準確性后，那么組裝時用到的高深度consensus序列準確性怎么樣呢？官方比較了同一樣本不同芯片測結(jié)果的準確性，見圖3。從結(jié)果可知，相同測序深度的情況下，consensus后序列的準確性Q值，R10比R9.4.1提升了5~10之間，對應的準確性有的提升了1個百分點之多。
圖3?不同物種中R10和R9.4.1 reads準確度
從官方的數(shù)據(jù)顯示，當數(shù)據(jù)深度為50X時，R10測序數(shù)據(jù)的consensus序列的準確性已經(jīng)達到了Q44，即99.996%以上（圖4）。且隨著測序深度的增加，R10芯片一致準確性逐漸增加。官方對多物種測試發(fā)現(xiàn)，在100X的測序深度下，consensus準確性可以保持在Q45以上，在有些樣本上甚至已達到Q50（99.999％）水平（圖4），當然加大測序深度也可以想要達到更高水平，測試結(jié)果中，最高已經(jīng)達到了Q52（99.9994%）。需要注意的是，這都是未經(jīng)過二代測序數(shù)據(jù)矯正的結(jié)果！
圖4 ?不同測序深度下R10 consensus序列準確性比較
03、同聚物識別準確性：
同聚物的識別準確性是大家一直都比較關心的問題，從ONT官方釋放的測試結(jié)果顯示，相比于R9.4.1，R10版本芯片能夠顯著提高其在同聚物區(qū)域的堿基識別準確度，并且?guī)缀醪粫肴笔уe誤（圖5）。
圖5 R10、R9.4.1芯片在同聚物區(qū)域的測序準確度
04、數(shù)據(jù)錯誤分布：
官方通過檢測同一樣本R10和R9.4.1中的錯誤在基因組上的情況，發(fā)現(xiàn)R9.4.1與R10的錯誤在基因組上分布并不是完全重疊的，通過兩種版本芯片的數(shù)據(jù)進行混合分析，可極大地提高序列的準確性（圖6）。這表明了，在不使用二代數(shù)據(jù)的前提下，后續(xù)也可考慮通過R10和R9.4.1數(shù)據(jù)組合的方式來提高結(jié)果的準確度！
圖6?R10和R9.4.1錯誤分布情況
小結(jié)
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