植物石蠟包埋試劑盒使用方法

試劑盒組成

保存方法

試劑盒常溫運(yùn)輸，常溫保存，有效時間截止開封后 60 天。

產(chǎn)品介紹

植物石蠟包埋試劑盒，是一種在保留 RNA 完整性的同時又可進(jìn)行石蠟包埋獲得結(jié)構(gòu)完整性 更好的植物切片的試劑盒。目前常用的植物切片方法主要有徒手切片法、石蠟切片法、冷凍 切片法。徒手切片需要新鮮組織，即取即用無法長時間不存組織；冷凍切片法對于細(xì)胞結(jié)構(gòu) 大含水量較多的組織無法保證組織結(jié)構(gòu)的完整性；常規(guī)石蠟切片法無法保證組織 RNA 完整 性，無法適用于需要長期保存且對 RNA 有要求的試驗。本試劑盒通過低溫短時間固定透明， 并采用特定包埋石蠟可在包埋時有效降低了組織 RNA 降解。

適用組織類型

幼莖、主根（木質(zhì)化程度低）；莖尖分生組織、花芽；生長期籽粒（淀粉含量低）、胚珠、 花苞、葉片

需要而未提供的材料

Tween20、無水乙醇、超純水、移液器、離心管、吸頭、0.22um 針頭式過濾器、真空濃縮儀、 恒溫箱、包埋盒

操作步驟

1 、開始前將組織固定液（確定已添加無水乙醇）吸取 4ml 于 5ml 離心管，放置 4℃預(yù)冷

2 、樣品準(zhǔn)備：用超純水徹底清洗組織表面所有雜質(zhì)，去除目標(biāo)區(qū)域組織周圍其余組織并將組織修整為 適合包埋大小。（為了石蠟更好滲透組織一般組織取材長度不超過 8mm，厚度不超過 5mm， 直徑不超過 1cm；若樣本內(nèi)部有空腔需盡可能暴露空腔，例：包埋花苞樣本時裁去花苞頂端 閉合的花瓣暴露空腔方便石蠟進(jìn)入)

3 、配置 10ml 0.05%Tween 20 ，并進(jìn)行預(yù)冷

4 、將修整好的組織放入 0.05%Tween20 中，室溫孵育 15min。

5 、取出孵育后的組織，將組織表面的試劑用無塵紙沾干。

6 、將組織放入預(yù)冷的組織固定液中，顛倒混勻，使組織完全浸沒并平放于 4℃過夜固定， 固定時間為 15-18h ，固定液體積需要超出組織體積的兩倍。同時將石蠟放置于 38.5℃恒溫 箱進(jìn)行溶解。

7 、吸取 4ml Buffer Ⅰ（確定已添加無水乙醇）置于冰上進(jìn)行預(yù)冷，取出固定后的組織，用無 塵紙吸取組織表面多余液體，放入預(yù)冷好的過渡液 1 中，冰上孵育 1h 。同時將 BufferⅡ至于 38.5℃恒溫箱中溶解。

8 、吸取 4ml 組織透明液置于冰上進(jìn)行預(yù)冷，取出孵育后的組織，用無塵紙吸取組織表面多 余液體，放入預(yù)冷好的組織透明液中，冰上孵育 1.5h。

*注意：組織在孵育試劑轉(zhuǎn)換的過程中需快速進(jìn)行，以免組織表面試劑揮發(fā)造成組織表面出現(xiàn)皺縮或風(fēng)干

9 、BufferⅡ顛倒混勻后，取 1.2ml 置于 1.5ml 離心管中，取出孵育后的組織，用無塵紙吸取組織表面多余液體后將組織放入 BufferⅡ中，將離心管開蓋放入真空濃縮儀中進(jìn)行抽真空1.5h。

*注意：若組織放入 BufferⅡ后 ，試劑出現(xiàn)凝固可置于恒溫箱中溶解后再進(jìn)行抽真空操作， 真空濃縮儀溫度 42℃ , 壓力小于 40KPa ，轉(zhuǎn)速 1300-1500rpm。

10 、將溶解好的石蠟顛倒混勻，取出離心后的組織，將組織放置于盛有 1.2ml 石蠟的 1.5ml 離心管中，之后將其放入真空濃縮儀中進(jìn)行抽真空 2h ，間隔 1h 跟換一次新石蠟。

11 、抽真空結(jié)束后取出組織，將石蠟加入包埋盒，并將組織按照切片方向放置，調(diào)整好后放 置于冰上凝固冷凍。

*注意：多個組織需將組織放置于同一平面，且組織需處于包埋盒中間位置，組織任何邊緣不能靠近包埋盒邊緣 ，以免切片組織破碎。

12 、將已凝固的包埋塊小心放于-20℃ , 冷凍 2h。

13 、將已凝固的包埋塊用錫紙包裹小心保存于-80℃ , 避免劇烈磕碰，劇烈磕碰易導(dǎo)致石蠟 塊出現(xiàn)裂縫。

*注意：從-20 轉(zhuǎn)到-80 或者干冰的時候，包埋盒的底部一定不要接觸到干冰或者冰箱底面?？蓪窈屑芷?，讓其緩慢冷卻 ，快速冷凍石蠟可能會產(chǎn)生裂紋

常見問題分析

1 、固定后組織變色或者部分變色

可能原因：組織固定液造成的組織脫色，不影響后續(xù)包埋可繼續(xù)包埋流程。

2 、石蠟溶解后出現(xiàn)白色團(tuán)塊或未能完全溶解

建議措施： ①升高溶解溫度，待完全溶解后在 38.5℃恒溫。

3 、浸蠟后組織靠中心結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)白色，組織邊緣結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)透明 可能原因：組織浸蠟不完全

建議措施：加長浸蠟時間，但不可加長超過 1h ，浸蠟時間影響組織 RNA 完整性。