全基因組甲基化測(cè)序（wgbs）實(shí)驗(yàn)流程材料方法

1、提取方法

1. 樣本研磨
2. 將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動(dòng)物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過(guò)1h
3. 溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫
4. 12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的0 ml 無(wú)菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min
5. 吸取上清液700 ul至新的0 ml 無(wú)菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min
6. 吸取上清液450 ul至新的5 ml無(wú)菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h
7. 12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時(shí)離心，用200ul槍頭吸棄多余液體
8. 向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清
9. 瞬時(shí)離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開(kāi)蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀
10. 加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動(dòng)物組織在裂解時(shí)加入2%的蛋白酶K；宏基因組項(xiàng)目提取在裂解時(shí)加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測(cè)方法

2.1?檢測(cè)方法

使用?Qubit（廠家YEASEN, 型號(hào)CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ?）檢測(cè)核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)完整性

2.2?判定標(biāo)準(zhǔn)

• 濃度≥1.25ng/ul
• 總量大于等于?10ng
• 完整性主帶清晰、主帶不清晰，輕微拖帶在2K以上
• 核酸狀態(tài)正常

3、建庫(kù)方法

3.1?基因組打斷

1. 取適量基因組DNA至6mL進(jìn)口離心管，混入1%的lambda DNA
2. 使用Bioruptor Pico，根據(jù)核酸質(zhì)量情況設(shè)置好打斷參數(shù)，進(jìn)行超聲波打斷

3.2?打斷產(chǎn)物純化

1. 加入適量體積的Vazyme DNA Beads至打斷后的DNA中，吹吸混勻，室溫靜置5min，瞬時(shí)離心
2. 置于磁力架上，靜置5min，移棄上清液
3. 加入新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液；連續(xù)清洗2次后瞬時(shí)離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
4. 離心管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，室溫干燥至磁珠表面無(wú)光澤，有細(xì)微裂紋
5. 取下離心管，加入無(wú)菌水，吹吸混勻，室溫靜置，而后磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的2mL PCR 管中

3.3?亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化

1. 將CT Conversion Mix平衡至室溫并渦旋混勻，于Nuclease-free PCR管中加入CT Conversion Mix和Input DNA
2. 渦旋或者吹打混勻后短暫離心，將反應(yīng)液收集至管底
3. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置好程序運(yùn)行

3.4?轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純化

1. 將E-Binding Buffer加入至EpiArt DNA Columns (each in a 2 ml Collection Tube)，將轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至EpiArt DNA Columns。溫和地上下顛倒混勻6 – 8次，使反應(yīng)產(chǎn)物與E-Binding Buffer完全混勻，離心
2. 棄濾液，沿管壁加入100 μl E-Wash Buffer 至EpiArt DNA Columns，離心
3. 沿管壁加入E-Desulphonation Buffer至EpiArt DNA Columns，室溫(15 ~ 25℃)下靜置反應(yīng)15 min，離心
4. 沿管壁加入 E-Wash Buffer至EpiArt DNA Columns，離心
5. 重復(fù)步驟4，棄濾液，空柱離心將多余的廢液離心至管底
6. 棄EpiArt DNA Columns，將DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)入新的2mLPCR管，產(chǎn)物保存于-30 ~ -15℃，長(zhǎng)期保存需放置于-85 ~ -65℃，以防降解

3.5?轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加接頭

1. 預(yù)熱PCR儀：熱蓋設(shè)為105℃，反應(yīng)溫度設(shè)置為95℃。在5 mL離心管管中配制好后續(xù)反應(yīng)試劑，用移液器輕輕吹打混勻后置于冰上待用
2. 將上一步驟轉(zhuǎn)化純化產(chǎn)物瞬時(shí)離心，置于預(yù)熱的PCR儀上，95℃加熱2 min ，迅速置于冰上靜置2 min。DNA變性后立即置于冰上，避免已變性為單鏈的DNA慢慢復(fù)性
3. 室溫解凍3′ Ligation Buffer 、3′ Ligation Enzyme Mix和3’Adapter，上下顛倒混勻后備用
4. 在5mL離心管中配制如下3’Adapter Ligation預(yù)混液（步驟3解凍的試劑）
5. 將3′ Adapter Ligation預(yù)混液與已變性的DNA用移液器輕輕吹打混勻后短暫離心，將反應(yīng)液收集至管底
6. 將反應(yīng)管置于PCR儀中，設(shè)置好程序運(yùn)行

3.6?單鏈DNA延伸

1. 室溫解凍Extension Primer和Extension Enzyme Mix，上下顛倒混勻后備用
2. 于上一步驟反應(yīng)管中加入延伸試劑Extension Primer、Extension Enzyme Mix
3. 使用移液器輕輕吹打混勻后瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液收集至管底
4. 將PCR管置于PCR儀中，按照程序運(yùn)行

3.7?反應(yīng)產(chǎn)物純化

1. 瞬時(shí)離心連接反應(yīng)管，加入2x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸10次充分混勻
2. 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
3. 保持反應(yīng)管始終置于磁力架中，用排槍向反應(yīng)管中加入新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
4. 重復(fù)步驟（4）一次，第二次清洗后，瞬時(shí)離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
5. 反應(yīng)管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
6. 將反應(yīng)管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取上清至新的PCR管中

3.8?5’端連接接頭

1. 室溫解凍5′ Ligation Mix和5′ Adapter，上下顛倒混勻后備用
2. 于上一步驟反應(yīng)管中配制如解凍后的試劑，使用移液器輕輕吹打混勻后瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液收集至管底
3. 將PCR管置于PCR儀中，按照程序運(yùn)行
4. 反應(yīng)產(chǎn)物純化，同步驟7

3.9?片段篩選

1. 向上述純化后的PCR管中加入5×已混勻的磁珠，吹吸10次混勻，室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，靜置5 min，吸取全部上清液至新的PCR管中
2. 加入15×已混勻的磁珠，吹吸10次混勻。室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，靜置5 min，移棄上清液
3. 加入100 μL新鮮配制的80%乙醇清洗磁珠（不可對(duì)著磁珠吹吸），磁力架上靜置30s，移棄上清液
4. 重復(fù)上步驟一次，第二次清洗后用10 μL槍頭將上清液徹底去除干凈
5. PCR管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，室溫干燥1 min；取下PCR管，加入nuclease-free water，吹吸10~15次混勻，室溫靜置5 min；而后磁力架上靜置5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的PCR管中

3.10?PCR 擴(kuò)增

1. 將VAHTS HiFi Amplification Mix V3和Index Primers*解凍后顛倒混勻，加入上一步驟反應(yīng)管中
2. 混勻，瞬時(shí)離心，置于PCR儀中按照程序運(yùn)

3.11?PCR產(chǎn)物純化

1. 瞬時(shí)離心連接反應(yīng)管，補(bǔ)加25ul ddH2O，吹洗混勻后加入65 x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸充分混勻
2. 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
3. 保持反應(yīng)管始終置于磁力架中，向反應(yīng)管中加入200μL新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
4. 重復(fù)步驟3）一次，第二次清洗后，瞬時(shí)離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
5. 反應(yīng)管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
6. 將反應(yīng)管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取上清至新的PCR管中
7. 重復(fù)上述純化步驟進(jìn)行二次純化。加入65 x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸充分混勻
8. 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
9. 保持反應(yīng)管始終置于磁力架中，向反應(yīng)管中加入200μL新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
10. 重復(fù)步驟（10）一次，第二次清洗后，瞬時(shí)離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
11. 反應(yīng)管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
12. 將反應(yīng)管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取30 μL上清至新的PCR管中
13. 分裝2ulGX檢測(cè)

3.12?文庫(kù)質(zhì)檢

1. 質(zhì)檢方法：文庫(kù)通過(guò)Qsep-400進(jìn)行片段質(zhì)檢，?使用?Qubit?3?.0進(jìn)行文庫(kù)濃度的定量
2. 質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：濃度≥1ng/ul，峰圖在要求切膠范圍之內(nèi)，片段單一無(wú)雜峰

3.13?建庫(kù)試劑耗材

• 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒：EpiArt DNA Enzymatic MethyLation Kit，貨號(hào)EM301-00；EpiArt DNA Methylartion Library Kit For Illumina V，貨號(hào)NE103-00
• 產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTMDNA?Clean?Beads，?貨號(hào)N411-03
• 質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 ?標(biāo)準(zhǔn)DNA卡夾
• 定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki
• 5ml離心管、0.2mlPCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.14?建庫(kù)設(shè)備

設(shè)備	廠家
PCR儀	艾本德
金屬浴	天根
掌上離心機(jī)	天根生化
漩渦震蕩器	SCIENTIFICINDUSTRIES.INC
移液槍	RAININ 瑞寧
磁力架	Life
相機(jī)	索尼
冰箱	海爾
四維旋轉(zhuǎn)儀	海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司
質(zhì)檢使用儀器	Bioptic-Qsep400
定量使用儀器	賽默飛Qubit 3.0
超聲波破碎儀	Bioruptor Pico非接觸式全自動(dòng)超聲波破碎儀、Diagenode
水浴鍋	北京三二八科學(xué)儀器有限公司

4、測(cè)序方法

測(cè)序設(shè)備：NovaSeq X plus

測(cè)序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit