LncRNA實(shí)驗(yàn)流程方法

 

1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒

3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號： Nanodrop2000）對于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測，并使用LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進(jìn)行檢測

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN 值≥4.0（非植物），RIN 值≥4.0（植物），同時(shí)若 GX 檢測 6.0-4.0 的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫方法

3.1rRNA去除

1) rRNA與探針結(jié)合

A.將對應(yīng)物種的去rRNA探針混合物加入到準(zhǔn)備好的總 RNA 樣品中，混勻離心，68℃孵育確保RNA變性

B.孵育結(jié)束后，將PCR管置于室溫，孵育2 min

2)rRNA探針復(fù)合物的捕獲與去除

A.吸取 RRB（rRNA Removal Beads）至新1.5 mL Nuclease-free離心管中

B.將上步中的RNA/Probe混合物轉(zhuǎn)入RRB中并立即迅速混勻，然后再渦旋混勻，室溫孵育5 min

C.孵育結(jié)束后再中速渦旋，然后置于磁力架上2 min至上清液澄清

D.轉(zhuǎn)移上清液到新離心管中，補(bǔ)加Nuclease-free Water，置于磁力架上至上清液澄清，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中

3) rRNA-depleted RNA的純化及打斷

A.向上述反應(yīng)產(chǎn)物加入相應(yīng)體積的（1.8X）已混勻的磁珠，混勻，室溫孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到磁力架一側(cè)后移棄上清液

B.向反應(yīng)管中加入新鮮配制的80% ethanol，磁力架上靜置30s，移棄上清液，重復(fù)該步驟1次

C.打開管蓋，空氣干燥至磁珠表面無光澤，有細(xì)微裂紋，加入Frag/Prime Buffer洗脫，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，轉(zhuǎn)移至新的Nuclease-free 0.2 mL離心管中，PCR儀高溫打斷，打斷完成后立即放在冰上

3.2合成 cDNA 第一條鏈

向上步反應(yīng)的離心管中加入反轉(zhuǎn)錄合成所需的試劑1st Strand Buffer 2、1st Strand Enzyme Mix 2及Actinomycin D (5mg/ml)，混勻離心后放入PCR儀中設(shè)定好程序進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。

3.3合成 cDNA 第二條鏈（含末端修復(fù)及接頭連接）

1)向合成的 cDNA 第一條鏈產(chǎn)物中依次加入二鏈合成反應(yīng)的試劑2nd Strand Buffer 2（with dUTP）、2nd Strand Enzyme Super Mix，混勻離心后，放在PCR儀中孵育完成二鏈的合成

2)運(yùn)行結(jié)束后加入末端修復(fù)及接頭連接的試劑：Rapid Ligation Buffer 3、Rapid DNA Ligase 2及IDT接頭，混勻離心后，放在PCR儀中運(yùn)行程序

3.4末端修復(fù)及 3’-末端加A

向上述純化產(chǎn)物中加入末修試劑，放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行接頭連接

3.5連接接頭及產(chǎn)物純化

1)向上述反應(yīng)產(chǎn)物加入0.9X已混勻的磁珠，混勻，室溫孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到磁力架一側(cè)后移棄上清液

2)離心管置于磁力架上，加新鮮配制的 80% ethanol，靜置 30s，移棄上清液

3)重復(fù)步驟 2 一次，第二次清洗后離心用 10ul 槍頭將上清液去除干凈

4)離心管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥

5)取下離心管，加入Nuclease-free Water，混勻，室溫孵育，而后置于磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的 離心管中

3.6PCR 擴(kuò)增

向上述離心管中加入 PCR 反應(yīng)所需的各種試劑，混勻后離心，根據(jù) PCR 反應(yīng)條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增

注意：primer中包含Index序列，使用時(shí)需嚴(yán)格按照上機(jī)調(diào)度安排的序列添加

3.7PCR 產(chǎn)物純化

1)瞬時(shí)離心 PCR 反應(yīng)管，加入相應(yīng)體積的磁珠，充分混勻

2)室溫孵育，然后置于磁力架上靜置，小心移除上清液

3)向反應(yīng)管中加入新鮮配制的 80% ethanol ，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液，重復(fù)該步驟 1 次

4)打開管蓋，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脫 DNA ，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，小心 吸取上清至新的離心管中，并分裝 1.5 μL 于新的 1.5 mL 離心管中用于片段檢測，-20℃保存

3.8文庫質(zhì)檢

文庫通過 Qsep-400 方法進(jìn)行質(zhì)檢，滿足如下指標(biāo)即可上機(jī)檢測：

3.9引物接頭序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.10建庫試劑耗材

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)，貨號N406-01

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Plant)，貨號N409-02

1)文庫構(gòu)建試劑盒

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)，貨號N406-01

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Plant)，貨號N409-02

2)產(chǎn)物純化磁珠

VAHTSTM DNA Clean Beads，貨號N411-03

VAHTSTM RNA Clean Beads，貨號N412-02

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.11建庫設(shè)備

4、測序方法

測序設(shè)備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTM X? Series25B Rgt Kit