Hi-C實(shí)驗(yàn)步驟流程及材料方法

 

1、固定

1.1植物組織

1)配置固定Buffer

2)實(shí)驗(yàn)步驟

A.收集4g新鮮、干凈、長勢完全正常的幼嫩組織樣品（如有污物，需要提前處理干凈），并至于冰上

B.每2g收集的新鮮組織使用剪刀剪成碎片，各放置于一個50ml的離心管中

C.往50ml離心管中添加提前預(yù)冷的35ml固定Buffer和2ml 36%的甲醛溶液，室溫下，旋轉(zhuǎn)雜交爐或者其它可旋轉(zhuǎn)設(shè)備中旋轉(zhuǎn)反應(yīng)90min

D.加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

E.濾掉固定液，用無菌ddH2O清洗幾次（至無泡沫）

F.吸干樣品表面水分，將樣品至于液氮中研磨

G.每4g研磨后的樣品存于一個50ml離心管中，并將離心管至于自封袋中，在-80℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2動物組織

1)取1g處理干凈的組織樣，將樣本置于液氮中充分研磨

2)將研磨后的組織置于預(yù)冷的50ml離心管中，加入30ml 1xPBS充分混勻

3)使用Falcon細(xì)胞網(wǎng)過篩2次（100um+40um），除去雜質(zhì)，收集濾液，加入35ul PMSF和適量的1x PBS，補(bǔ)至35ml

4)加入2ml 37%甲醛，室溫條件下置于旋轉(zhuǎn)搖床上反應(yīng)60min

5)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

6)3000g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

1.3速凍植物組織

1)取50mg速凍組織樣于2ml國產(chǎn)離心管中，加入鋼珠，使用打碎儀液氮充分研磨

2)在研磨后的組織中加入1ml的NIBuffer工作液1中，震蕩混勻之后過100um的濾網(wǎng)，補(bǔ)充適量的NIBuffer工作液1至全部過濾完成，使用50ml離心管收集濾液（冰上操作）

3)在濾液中加入巰基乙醇、PMSF和37%甲醛溶液，室溫雜交反應(yīng)一定時間

4)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

5)3000g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

1.4細(xì)胞

1)用1ml 1x PBS重懸細(xì)胞樣品（要求客戶自己固定完成），轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中

2)4℃ 650g離心10min，棄上清

3)將1ml Lysis Buffe 工作液加入到裝有樣品沉淀的離心管中，充分混勻，重懸樣品

4)離心管放在冰上，并置于搖床上100r，混勻15min

5)650g，4℃，離心10min，棄掉上清，保留沉淀

1.5血液

1)取1ml新鮮全血至50ml離心管中，加入3ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻

2)冰上放置15min（每5min顛倒混勻一次）

3)4℃450g離心10min，棄掉上清

4)加入2ml的紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻白細(xì)胞

5)4℃450g離心10min，棄掉上清

6)加入45ml 1XPBS，重懸沉淀

7)加入2.5ml37%甲醛，充分混勻，室溫旋轉(zhuǎn)雜交60min

8)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

9)650g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

2、細(xì)胞裂解和酶切

1)配置適當(dāng)裂解體系冰上裂解細(xì)胞

2)用梯度密度離心法從裂解的細(xì)胞中提取細(xì)胞核

3)用限制性內(nèi)切酶酶切細(xì)胞核

3、末端標(biāo)記和平端連接

1)配置適當(dāng)標(biāo)記體系對末端標(biāo)記生物素

2)將補(bǔ)平的末端用T4 DNA連接酶進(jìn)行平末端連接

4、DNA純化（解交聯(lián)）

1)配置解交聯(lián)反應(yīng)試劑

2)將解交聯(lián)反應(yīng)試劑加入樣品中，充分混勻，金屬浴55℃，900rpm反應(yīng)30min

3)加入適量的NaCl溶液，充分混勻，金屬浴65℃，900rpm反應(yīng)90min

4)反應(yīng)結(jié)束后5000rpm室溫離心3min，取上清液至新的離心管中

5)加入XP磁珠，混勻瞬時離心，室溫孵育10min

6)將樣品放置于磁力架上，直到液體澄清

7)小心棄掉上清液，加入200ul新鮮配置的80%乙醇，靜置20s，棄掉上清液

8)重復(fù)步驟7

9)取下離心管，瞬時離心，吸干凈殘留的液體

10)室溫靜置3min，待磁珠表面呈現(xiàn)磨砂狀

11)將離心管從磁力架上取下來，加入85ul EB，充分混勻磁珠，室溫靜置5min

12)將離心管置于磁力架上，待到液體澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中

5、Hi-C文庫制備（采用Mate-pair Kit）

5.1文庫制備流程

取1ug DNA樣品（體積最大取41ul）除去末端標(biāo)記但未連接的DNA，金屬浴反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)

1)Ampure XP磁珠純化DNA

A.取90ul的XP磁珠至上述反應(yīng)結(jié)束的離心管中，用移液器吹吸混勻，瞬離后室溫靜置5min

B.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心棄掉上清液

C.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

D.重復(fù)步驟C

E.取下樣品管，瞬時離心，吸干殘留的液體

F.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可

G.從磁力架上取下離心管，加入18ul NF水，混勻重懸磁珠，室溫孵育5min

H.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心吸取上清液至新的離心管中備用

2)片段化、末端修復(fù)及加A

A.取0.5ug（最大體積17ul）純化后的DNA

B.加入配置好的反應(yīng)試劑，混勻后瞬離

C.置于PCR儀中按照設(shè)置好的程序進(jìn)行反應(yīng)

3)接頭連接及純化

A.在反應(yīng)結(jié)束后的樣品中加入接頭連接需要的試劑

B.吹吸混勻，瞬離后置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)

C.在反應(yīng)結(jié)束的樣品中加入50ul的XP磁珠，混勻瞬離，室溫反應(yīng)5min

D.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心棄掉上清液

E.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

F.重復(fù)步驟E

G.取下樣品管，瞬時離心，吸干殘留的液體

H.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可

I.從磁力架上取下離心管，加入28ul NF水，混勻重懸磁珠，室溫孵育5min

J.直到液體澄清后小心轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中

4)目標(biāo)捕獲

A.使用TWB和BB試劑重懸C1磁珠

B.取10ul重懸后的使用BB溶解的磁珠，加入純化后的樣品中

C.混勻后置于旋轉(zhuǎn)的混勻儀反應(yīng)15min

5)PCR文庫擴(kuò)增及片段篩選

A.將樣品置于磁力架上，待液體澄清之后棄掉上清液

B.分別使用200ul的BB試劑和NEB試劑重懸磁珠

C.棄掉上清，瞬離，離心管置于磁力架上，用槍頭吸干殘留的液體

D.室溫靜置2-4min，至磁珠表面無明顯水珠

E.取下離心管，加入10ul的NF水，重懸磁珠，用于PCR擴(kuò)增

F.配置好PCR擴(kuò)增試劑后，混勻，連同磁珠一起置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增

G.PCR結(jié)束后，將樣品置于磁力架上，待液體澄清后吸取上清液至新的離心管中

H.補(bǔ)水至50ul，并加入30ul的XP磁珠，吹吸混勻室溫靜置5min

I.置于磁力架上，待液體澄清后，棄掉上清

J.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

K.重復(fù)步驟J

L.取下樣品管，瞬時離心，吸干殘留的液體

M.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可

N.取下樣品管，加入30ul的Elution Buffer，混勻，瞬離，室溫靜置5min

O.置于磁力架上，待液體澄清后吸取上清液進(jìn)行文庫質(zhì)檢

5.2文庫質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫通過 Qsep-400 進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用酶標(biāo)儀進(jìn)行文庫濃度的定量

2)庫檢標(biāo)準(zhǔn)：庫檢片段呈正態(tài)分布狀，300bp起峰，800bp落峰；片段無前后拖尾、無接頭、無雜峰；濃度大于1ng/ul

5.3建庫用試劑耗材

1)文庫構(gòu)建試劑盒：VAHTSTM Fg DNA Library Prep Kit? for I11umina 貨號ND617-02

2)產(chǎn)物純化磁珠：Agencourt? AMPure? XP，貨號A63882

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

5.4建庫用設(shè)備

 

6、測序方法

測序設(shè)備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit