空間轉錄組樣本制備要求

1、前言

1.1 適用范圍

本指南介紹百邁客實驗平臺空間轉錄組產品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細閱讀。

1.2 聲明

我國法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風疹、麻風病、急性出血性結膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

涉及上述傳染病的科學研究需符合國家的相關規(guī)定，為嚴格遵守國家法律法規(guī)，本著對社會及相關操作人員負責的態(tài)度，我司要求客戶方真實準確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進行事先說明。樣品中含有上述感染性病原體時，客戶方需要提供符合生物安全等級要求的實驗室以便開展相關實驗，實驗進行時，客戶方有義務協(xié)助我方實驗員做好實驗安全防護?？蛻舴讲坏秒[瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經發(fā)現(xiàn)我司將停止進行相關項目，已產生的費用由客戶方承擔。如因客戶方提供的生物安全性信息不實、隱瞞樣品感染性等有關情況等造成實驗員及相關人員被感染、疾病傳播等嚴重后果的，我司將按規(guī)定報告國家相關部門，并將通過法律等手段追究相關責任。

2、項目流程

目前百邁客空間轉錄組測序服務模式默認為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門服務，請與百邁客技術人員確認實驗室儀器設備情況。

組織寄送前請至少提前1周進行預約，百邁客接收到樣本并確認樣本無異常后，3-5天內安排RNA質檢并反饋質檢結果，質檢合格后安排切片、組織結構確認與透化。

3、新鮮冷凍樣本

3.1 樣本要求

10x空間轉錄組每塊組織樣本長寬不宜超過6.5*6.5mm，百創(chuàng)S3000空間轉錄組每塊組織樣本長寬不宜超過6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S2000A空間轉錄組每塊組織樣本長寬不宜超過11*11mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個包埋成一個OCT包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面充分利用捕獲區(qū)域。

注1：在樣本量足夠的情況下，每個動物樣本最好準備至少2個包埋塊，1份用于RNA質檢（切片質控標準見第3部分）、切片選片、上透化芯片和表達芯片，另1份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

注2：在樣本量足夠的情況下，每個植物樣本最好準備至少3個包埋塊，因植物組織目的結構較薄，實驗建議進行全流程方案進行空間實驗，即一個包埋塊在一次切片實驗中完成結構確認，貼片表達，貼片透化，避免反復切片導致結構損失，其余2塊用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

3.2 樣本采集與運輸

3.2.1 采集前準備

1. 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預冷；
2. 在醫(yī)用托盤上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無菌布，將個體放在無菌布上進行取樣，保持整個取樣過程在低溫中進行，可以延緩核酸的降解，（動物組織建議針對活體或剛死亡個體進行解剖取樣）；
3. 動物組織如果取樣后無法立即進行后續(xù)包埋實驗，可以將樣本清理干凈后，暫時放入組織保護液（美天旎，貨號130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時間最長不要超過5h，以免造成RNA降解，RIN值質檢不合格；
4. 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）進行包埋，OCT使用前在冰上預冷30分鐘。

3.2.2 動物樣本采集

1. 取下新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈）；
2. 迅速用預冷的 PBS溶液（RNase?free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無菌紗布吸凈表面液體；
3. 如果組織體積較大，需要將組織切成長寬＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊，用7*7*5mm的特小號包埋盒進行包埋；取下的組織應立即進行后續(xù)包埋實驗。

注：原則上實驗室不提供組織冷凍包埋相關試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運營確認實驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運送，實驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.3?植物樣本采集

1. 培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本：在無菌超凈臺中取出組織，去除組織表面附著的培養(yǎng)基，用超純水將組織表面清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀將目標區(qū)域外的組織結構盡量去除，若組織內部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
2. 土壤培養(yǎng)樣本：將組織從培養(yǎng)土中完整取出，去除土壤及雜質，用超純水將組織表面土壤及雜質徹底清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀將目標區(qū)域外的組織結構盡量去除，若組織內部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
3. 將目標組織按照不同組織類型包埋方法進行包埋

注：原則上實驗室不提供組織冷凍包埋相關試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運營確認實驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運送，實驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.4?動物組織速凍包埋

下文提供了2種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶可根據(jù)實驗條件進行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護細胞完整性，但操作較復雜，而且異戊烷對人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進行冷凍包埋。

方法1干冰包埋法（常用）

無需異戊烷，直接用干冰粒進行包埋。

1. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
2. 標記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；
3. 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產生氣泡；
4. 冰上預冷鑷子，將組織放入OCT中，調整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；
5. 將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會影響組織的方向，同時能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。
6. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法2?異戊烷+液氮包埋法

腦組織等容易形成冰晶或者水腫病變組織推薦使用此方案進行包埋。

1. 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育15分鐘；
2. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
3. 標記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；
4. 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產生氣泡；
5. 冰上預冷鑷子，將組織放入OCT中，調整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；
6. 用鑷子將包埋盒放到異戊烷上，不要使異戊烷浸入包埋盒內，直到組織凍結，冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化（如下圖）；
7. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運輸。

3.2.5 植物組織速凍包埋

下文提供了 3 種包埋方法，根據(jù)植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：

方法一?：抽真空+干冰冷凍OCT包埋（不需要固定）

1）按照2.3植物采樣方法裁取樣本，空隙較多組織（花苞、莖尖）需將組織部分切開，目標區(qū)域外組織需盡可能全部去除。

2）將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。

3）冰上預冷75% OCT包埋劑溶液（5mlOCT+2.5ml滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入1ml 75%OCT，將植物組織浸潤在其中，將平底的無吸附膜的吸附柱放入1.5ml離心管中，以防止抽真空過程組織上浮在OCT表面，打開所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空10min，摸索設置成V-AQ，促進OCT溶液充分包裹和進入組織空隙中，保證OCT填充包埋組織的完整性。如下圖：

4）將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

5）在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的OCT，緩慢放入預冷的含OCT的包埋盒中 ，加預冷的OCT直至完全包裹組織，并調整組織在OCT中的位置 ，保證目標平面與切面水平一致，如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起，此過程中避免產生氣泡，如有氣泡產生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。

6）將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會影響組織的方向，同時能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。

7）將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法二?：直接冷凍OCT包埋（無需抽真空）

1. 按照2.3植物采樣方法裁取樣本
2. 將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。
3. 將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。
4. 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預冷的OCT包埋劑中 ，直至OCT完全包裹組織。
5. 調整組織在OCT中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標平面與切面水平一致。如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產生氣泡，如有氣泡產生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。
6. 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育5- 10分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結 。（若無異戊烷及液氮可使用干冰包埋）
7. 用鑷子夾住包埋盒置于預冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待OCT凝固變白。
8. 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標記，利用干冰運輸。

方法三?：石蠟包埋

石蠟包埋請使用百邁客專用試劑盒(試用裝)，此試劑盒適用于主根、莖、幼果（含水量大）等組織類型，OCT切片破碎的組織也可以使用此試劑盒嘗試包埋切片。

詳細操作步驟請查看試劑盒說明書（此試劑盒目前為試用裝，未正式發(fā)布，有需求可溝通銷售）

3.2.6?樣本寄送運輸

包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長期保存，或者放置在干冰上進行冷凍運輸，寄送到百邁客實驗室，干冰寄送推薦用量約5kg/日。

不規(guī)范送樣示例：

A.包埋時組織放置靠近最下層，組織未被OCT包裹，導致樣本RNA降解，質檢不合格；

B.組織暴露在空氣中，導致樣本降解，組織兩側無OCT支撐，展片時可能會破壞樣本結構；

C.組織較小，不滿足做表達最小25%的要求；

D.同一個包埋塊包埋了多個樣本，但不在同一個平面，并且每一個樣本組織過小，覆蓋區(qū)域有限，可能導致分析有效數(shù)據(jù)偏低。

3.3?切片質控標準

• 組織形態(tài)學檢測：對動物組織切片進行H&E染色，對植物組織切片進行甲苯胺藍染色，觀察是否獲取到目標區(qū)域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。
• RNA完整性檢測：收取10-15張切片，利用Agilent2100對樣本進行RNA完整性檢測，要求RNARIN≥6，則認為樣本完整性滿足實驗要求，可以進行后續(xù)實驗。具體切片質檢量如下：

1）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的1/5-1/4，質檢量要求~20張（左圖）；

2）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質檢量要求~15張（右圖）。

3.4 測序數(shù)據(jù)量推薦

測序數(shù)據(jù)量：10x Genomics推薦60G/樣，百創(chuàng)S3000推薦250G/樣；

測序平臺：SURFSeq?5000