前言
1. 適用范圍
本指南介紹百邁客 DNA 類組織樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請?jiān)敿?xì)閱讀。
2. 聲明
對于危害程度為第一、二類的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織 樣。對于危害程度為三、四類的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過銷售或運(yùn)營與醫(yī)學(xué) 實(shí)驗(yàn)平臺負(fù)責(zé)人溝通，確認(rèn)無高致病和傳染性且能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)后再安排樣品寄送。危害 程度的判定標(biāo)準(zhǔn)具體參見《人間傳染的病原微生物名錄》 。
3. 提取風(fēng)險(xiǎn)提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境 等因素息息相關(guān)，故無法完全保證提取質(zhì)量，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障 獲得相對較高質(zhì)量的核酸，請老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。
樣本準(zhǔn)備前注意事項(xiàng)
1. 取樣的代表性
所采集的樣本應(yīng)該通過嚴(yán)格的細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)等相關(guān)鑒定，因?yàn)檫@關(guān)系到實(shí) 驗(yàn)最終結(jié)果是否具有科學(xué)意義，所以客戶須根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)相關(guān)科學(xué)取樣方案和取樣步 驟。
2. 取樣的準(zhǔn)確性
正常組織樣本中不能含有病變組織，而病理組織樣本中也不可以夾帶有正常組織。在 條件允許的前提下，爭取做到實(shí)驗(yàn)組與對照組的樣本在取材時(shí)間、部位、 處理?xiàng)l件等方面 盡可能保持一致，否則可能會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可信度。 代表性樣本的各種特征數(shù) 據(jù)必須被準(zhǔn)確記錄，并按要求采集、制備、儲存、運(yùn)輸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。
3. 取樣的重復(fù)性
生物學(xué)重復(fù)的取樣應(yīng)盡量減少重復(fù)間樣品的差異。在條件允許的前提下，做到重復(fù)樣 本在取材時(shí)間、部位、 處理?xiàng)l件等方面盡可能保持一致，否則可能會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù) 性和可信度。
4. 取樣的及時(shí)性
樣本質(zhì)量是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最關(guān)鍵因素，因此用于研究的實(shí)驗(yàn)樣本，在采集、貯存、 運(yùn)輸和制備的過程中盡可能地做到迅速，最大限度的縮短從樣本采集到實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。
5. 取樣的低溫性
所取樣本離體后，經(jīng)快速清洗和標(biāo)記等處理后，應(yīng)立即投入液氮中速凍至少 3 h，之后 保存于-80 ℃ 冰箱或者干冰中，確保在實(shí)驗(yàn)操作前樣品始終處于-80 ℃，以避免 RNA 的降 解。
組織樣送樣量要求
DNA 提取組織送樣量要求
二代
| SLAF | 重測序 | 甲基化 | |
|---|---|---|---|
| ?新鮮動(dòng)物組織干重 | 0.5g | 0.5~1g | 1~2g |
| 新鮮植物組織干重 | 0.5~1g | 1~2g | 1~2g |
| 全血 | 1.5ml | 1.5ml | 2ml |
| 菌體（干重） | 1~2g | 1~2g | 1~2g |
三代
| ONT-動(dòng)植物基因組 | ONT-動(dòng)植物重 測序/甲基化 | PB-動(dòng)植物基因組 | |
|---|---|---|---|
| 肝臟/腎臟等內(nèi)臟組織 | ≥3.5g | ≥0.35g | ?≥3.5g |
| 肌肉 | ≥5.0g | ≥0.5g | ≥5.0g |
| 哺乳動(dòng)物血液 | ?≥5.0mL | ?≥0.5mL | ?≥5.0mL |
| 禽類/魚類血液 | ≥0.5mL | ≥0.1mL | ≥0.5mL |
| 新鮮葉片 | ≥5.0g | ≥0.5g | ≥5.0g |
| 花瓣/莖 | ≥10.0g | ≥1.0g | ≥10.0g |
| 根/種子 | ≥20.0g | ≥2.0g | ?≥20.0g |
| 培養(yǎng)細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)） | ≥1×10 8 | ??≥1×10 7 | ??≥1×10 8 |
菌類
| 組織類型/產(chǎn)品類型 | ONT-細(xì)菌/真菌 基因組 | ?PB-細(xì)菌/真菌基 因組 |
|---|---|---|
| 細(xì)菌 | ≥3.5×10 10 | ?≥3.5×10 10 |
| 單細(xì)胞真菌 | ≥3.5×10 10 | ≥3.5×10 10 |
| 大型真菌 | ≥10.0g | ≥10.0g |
* 注：不同類型的組織樣品，DNA 的提取得率差別較大，像人或哺乳動(dòng)物的全血中紅 細(xì)胞沒有細(xì)胞核，每毫升血液中實(shí)用細(xì)胞數(shù)少，DNA 得率比較低，送樣量需相應(yīng)增加；而 鳥類或魚類血液中紅細(xì)胞含有細(xì)胞核，DNA 得率會增高，送樣量可適當(dāng)減少。含肌纖維細(xì) 胞豐富的肌肉組織以及含多糖多酚較高的復(fù)雜植物，DNA 得率會受到影響。真菌的細(xì)胞有 含甲殼素（又叫幾丁質(zhì)）為主要成分的細(xì)胞壁，提取難度較大，建議盡量多準(zhǔn)備一些樣品。
核酸送樣要求
1.送樣要求
1.1 術(shù)語及定義
1.1.1 檢測項(xiàng)目:
m：總量（Total quantity），DNA 的總質(zhì)量
c：濃度（Concentration），DNA 溶液的 Qubit 檢測濃度
N/Q：Nanodrop 檢測濃度與 Qubit 檢測濃度的比值
Size：片段大?。‵ragment size），指 DNA 分子片段主帶大小
OD260/280：Nanodrop 檢測中 OD260 和 OD280 的比值，反映 DNA 純度的指標(biāo)之一
OD260/230：Nanodrop 檢測中 OD260 和 OD230 的比值，反映 DNA 純度的指標(biāo)之一
1.1.2 樣品質(zhì)量檢測方法:
Nanodrop：使用 Thermo Fisher NanoDrop 2000/8000 Spectrophotometer 進(jìn)行檢測的方法
Qubit：使用 Invitrogen Qubit Fluorometer 進(jìn)行檢測的方法
AGE：Agarose Gel Electrophoresis 即使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測的方法
1.2 DNA 樣品送樣量要求
請?zhí)峁?DNA 樣品的相關(guān)檢測結(jié)果，例如以下檢測手段中的一種或多種檢測結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE。請采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?DNA 樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解 DNA 所使用的溶解液類型。
檢測結(jié)果說明：
level A：A 類樣品，指純度、片段大小和濃度均合格，總量滿足按數(shù)據(jù)量計(jì)算總量要求的 樣品。
level B：B 類樣品，指純度、片段大小和濃度均合格，總量不完全滿足按數(shù)據(jù)量計(jì)算總量 要求的樣品。
level C：質(zhì)量不完全滿足建庫要求，可以風(fēng)險(xiǎn)建庫但不保證文庫大小與測序數(shù)據(jù)量的樣品。
level D：質(zhì)量完全不滿足建庫測序要求，不建議使用的樣品。
請您按照上述 A 類樣品的要求來準(zhǔn)備 DNA 樣品以確保后續(xù)建庫測序能夠正常進(jìn)行。如果 您準(zhǔn)備的 DNA 樣品不能滿足 A 類樣品指標(biāo)要求，并且后續(xù)不能提供更多的 DNA 樣品， 需要提前聯(lián)系銷售人員進(jìn)行咨詢。
2.二代核酸送樣要求
3.三代核酸送樣要求
樣本制備保存指南
1.植物組織
由于老葉或其它組織 DNA 含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對較高，因此， 為降低 DNA 提取難度并減少污染物干擾，請盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選 擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外 藻類組織中的水分會影響提取得率，取樣時(shí)需將組織樣中的水分吸干。新鮮組織樣采樣流 程如下：
1) 用 70%酒精將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再從植物體上取下新鮮組織?
2) 樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，將處理好的組織樣本混合均勻后保存于 2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中；并標(biāo)注編號。
3) 迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后按照順序依次放入樣品盒或者按照一定的規(guī)律（例 如 1-10,11-20 等）裝于自封袋中，轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存（禁止亂放，尤其是項(xiàng)目 中樣品個(gè)數(shù)較多時(shí)）；干冰運(yùn)輸。
*注：
①一定不要使用自封袋常溫寄送非干燥組織樣，天氣炎熱，高溫下組織樣易腐爛變質(zhì)， 易產(chǎn)生霉菌，導(dǎo)致提取的核酸中混有污染物種的核酸或提取失敗，影響公司成本的同時(shí) 給客戶造成不好的影響。
②干燥樣品現(xiàn)在不建議送樣，提取成功率低，如果只有干燥樣品，使用紙質(zhì)袋裝樣，在 外包裝自封袋中可以統(tǒng)一裝硅膠干燥顆粒。
2.動(dòng)物組織（不含昆蟲和水產(chǎn)類）
1) 活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、 可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織 類型。對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周 圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）；
2) 迅速用預(yù)冷的 PBS 溶液（RNase free）或 0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈
3) 如果組織體積較大，應(yīng)盡量將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?/p>
4) 將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的存管中
5) 迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存，送樣時(shí)干冰運(yùn)輸
注：整個(gè)樣品收集過程保證樣品斷血后半小時(shí)內(nèi)完成樣品制備
3.昆蟲
1）昆蟲樣本，建議進(jìn)行表面微生物的清洗，較大個(gè)體的盡量選取不帶腸道部分的組織， 對于較小個(gè)體只能用整個(gè)個(gè)體的，建議進(jìn)行適當(dāng)?shù)酿囸I處理（但需注意保證昆蟲的活 性）。
2）如果組織體積較大，應(yīng)盡量將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?/p>
3）將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的存管中
4）迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存，送樣時(shí)干冰運(yùn)輸
*注：蜜蜂送樣時(shí)盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個(gè)蜜蜂送樣提取的核酸狀態(tài)大多數(shù)異常， 影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不建議送實(shí)驗(yàn)室剔除，因?yàn)榻M織速凍過之后再剔除會化凍，提取降解的可 能性較大！
4.水產(chǎn)動(dòng)物
1）取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體；
2）如果是甲殼類（如蝦蟹等），需解剖活體組織，只取軟肉組織，將組織樣品割成約 50 mg 的小塊（約黃豆大小）
3）液氮速凍后，放入干凈的帶螺紋旋蓋保存管中；
4）轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。
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5.細(xì)胞
一次提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1 X 10 7 個(gè)，以 3 X 10 6 -1 X 10 7 個(gè)為宜，可以將細(xì)胞經(jīng)裂解 液裂解后凍存運(yùn)輸。
1) 從培養(yǎng)箱中取出貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，確定生長 狀態(tài)良好（正常細(xì)胞 confluence 在 80 %左右）
2) 棄去培養(yǎng)基，用 PBS 緩沖液快速洗一次，除去 PBS 緩沖液，貼壁細(xì)胞可用細(xì)胞刮 將其刮下
3) 收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)入 1.5 mL 的 EP 管中用液氮速凍后置于-80 °C 保存，一管裝一次提 取的量，可以將備份樣品單獨(dú)裝，禁止將一個(gè)樣品多次提取的細(xì)胞裝到一個(gè)管中， 干冰運(yùn)輸
注：由于細(xì)胞量少，干冰運(yùn)輸務(wù)必保證細(xì)胞處于冷凍環(huán)境，防止環(huán)境溫度增加細(xì)胞降解； 同時(shí)因樣本少易降解，務(wù)必備注信息單微量樣本液氮交接
6.全血樣本
1) 用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，不可用肝素）的 旋蓋管收集全血樣本
2) 上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī) EP 管中，轉(zhuǎn)移至-20 或-80 °C 長期保存（實(shí) 際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3) 干冰運(yùn)輸
注：
①血液采集管請盡量不要用需專門對應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無 對應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）
②采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至 EP 管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎不規(guī)范送樣玻璃管破碎 規(guī)范送樣
7.細(xì)菌
注意：所有菌類樣品必須分離好菌體或菌絲送樣，切勿連帶培養(yǎng)基一起寄送，帶培養(yǎng) 基的菌體無法提取。
1）顯微鏡下觀察細(xì)菌生長狀態(tài)，最好收集生長期處于對數(shù)期的細(xì)菌。
2）將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下 14000 ×g 離心 1 min。
3）棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍 1-3 h 以上（凍存時(shí)間視組織量 而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存。
4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸。
8.真菌
真菌的形態(tài)多樣，一般分為單細(xì)胞和多細(xì)胞真菌，酵母菌屬于單細(xì)胞真菌，而霉菌和 蕈菌（大型真菌）都屬于多細(xì)胞的真菌。
8.1 單細(xì)胞真菌
單細(xì)胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1×10 7個(gè)，以 5×10 6-1× 10 7個(gè)為宜。您要做的項(xiàng)目要求送樣量較大時(shí)，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨(dú)保 存。
1）顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，最好收集生長期處于對數(shù)期的酵母菌。
2）將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將 2 mL 旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于 室溫下 14000×g 離心 1 min。
3）棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍 1-3 h 以上（凍存時(shí)間視組織 量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存。
4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸。
8.2 大型真菌
大型真菌因種屬差異，生長形態(tài)差異很大。在制備大型真菌樣品時(shí)，可參考上述 1.1 植物組織制備方法。
核酸樣本
1) 第一種方案是提取完成后的 DNA 溶液直接放入-20 °C 冰箱中進(jìn)行保存；第二種方案 是采用醋酸鈉乙醇沉淀法沉淀 DNA，并且將樣品直接放入-20 °C 冰箱中進(jìn)行保存； 第三種方案是向沉淀后的 DNA 固體中直接加入 1 mL75 %的無水乙醇，并且將樣品 直接放入-30 °C 冰箱中進(jìn)行保存；第四種方案是提取完成后的 DNA 樣品使用低溫冷 凍儀冷凍成干粉（可常溫運(yùn)輸）
注：推薦用第一種方案
2) 樣品運(yùn)送前保存在-20 °C 冰箱，干冰運(yùn)輸
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