ATAC-seq+RNA-seq 聯(lián)合分析揭示斜帶石斑魚性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中染色質(zhì)的可及性

ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析，可以獲得ATAC檢測(cè)到的染色質(zhì)高度可及性區(qū)域與對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的相關(guān)性，以及對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本相關(guān)基因的上游調(diào)控序列，構(gòu)建TF結(jié)合后的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，從而整體分析該特定時(shí)空下從DNA到RNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并且相互驗(yàn)證，進(jìn)一步結(jié)合基因功能分析、實(shí)驗(yàn)表型進(jìn)行討論，清晰展現(xiàn)從表觀調(diào)控——基因表達(dá)——基因功能——表型的生物學(xué)過(guò)程。百邁客擁有完善的ATAC-seq與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析流程，云平臺(tái)配套專業(yè)豐富的分析工具，輕松滿足您的個(gè)性化分析需求！接下來(lái)，小編以一篇文獻(xiàn)為例帶領(lǐng)大家深刻認(rèn)識(shí)ATAC-seq與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析方案。

文章信息

中文標(biāo)題：ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析揭示了斜帶石斑魚性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中染色質(zhì)的可及性

英文標(biāo)題：Integration of ATAC-seq and RNA-seq Unravels Chromatin Accessibility during SexReversal in Orange-Spotted Grouper (Epinephelus coioides)

影響因子：6.208

期刊：International Journal of Molecular Sciences

研究目的

采用ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析斜帶石斑魚（雌雄同體）性腺在性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的開放染色質(zhì)區(qū)域和TF結(jié)合位點(diǎn)，以探究斜帶石斑魚性逆轉(zhuǎn)的分子機(jī)制。

研究亮點(diǎn)

• ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析構(gòu)建TFs及其靶基因的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)、探索性逆轉(zhuǎn)過(guò)程的潛在機(jī)制。
• 整體分析斜帶石斑魚性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中從DNA到RNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為斜帶石斑魚的基因組分析以及其他表觀遺傳學(xué)信息分析奠定基礎(chǔ)資料。
• ATAC-seq+RNA-seq+實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，清晰展現(xiàn)從表觀調(diào)控-基因表達(dá)-基因功能-表型的生物學(xué)過(guò)程。

研究背景

石斑魚（Epinephelus）是雌雄同體的魚類，在其生活史中經(jīng)歷了從雌性到雄性的性別變化，是研究性別分化和性別逆轉(zhuǎn)的良好模型。斜帶石斑魚是亞洲重要的經(jīng)濟(jì)石斑魚物種，其在自然條件下，于大約4-5齡時(shí)會(huì)改變性別。然而，斜帶石斑魚的性逆轉(zhuǎn)的分子機(jī)制仍不清楚。以往的研究表明，許多轉(zhuǎn)錄因子，如sox（性別決定區(qū)Y-box）、wnt（無(wú)翅基因/整合基因）、dmrt（dsx和mab-3相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）和nanos，在性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而，對(duì)性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄變化仍缺乏全面的了解。

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在維持基因表達(dá)的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，可接近的染色質(zhì)區(qū)域是轉(zhuǎn)錄因子（TFs）和順式元件的結(jié)合位點(diǎn)。因此，來(lái)自這些開放區(qū)域的信息將增強(qiáng)我們對(duì)TF結(jié)合、染色質(zhì)狀態(tài)和基因表達(dá)調(diào)控之間關(guān)系的理解。ATAC-seq是2013年開發(fā)的一種新方法，已在許多研究中廣泛應(yīng)用于檢測(cè)開放染色質(zhì)區(qū)域。該文首次在斜帶石斑魚性逆轉(zhuǎn)期間使用ATAC-seq對(duì)性腺的原始細(xì)胞核進(jìn)行檢測(cè)，揭示不同發(fā)育階段染色質(zhì)可及性的差異，以便從一個(gè)新的角度探索性逆轉(zhuǎn)的機(jī)制。作者采用ATAC-seq與RNA-seq聯(lián)合分析，以確定性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中幾個(gè)途徑中的TFs網(wǎng)絡(luò)和核心基因。此外，在這一過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)了一組與性別相關(guān)的基因。

研究方法

材料：斜帶石斑魚（體重1.90±0.65kg，體長(zhǎng)43.75±9.25cm）分為兩組，對(duì)照組（n=25）和MT植入組（10mg/kg;n=25）（廣東大亞灣漁業(yè)發(fā)展中心），水池養(yǎng)殖（T：22.7–27.8?C）。

實(shí)驗(yàn)方法：MT誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)：在植入前（第0周），隨機(jī)獲得5條魚的性腺以確定發(fā)育階段。MT植入后，每周分別從兩組中隨機(jī)抽取5條魚的性腺組織（每條魚的性腺切成三部分），實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5周。性腺的增殖檢測(cè)：免疫組織化學(xué)IHC分析；胞凋亡的檢測(cè)：TUNEL分析；組織定量表達(dá)：RT-qPCR；基因定位：原位雜交ISH。

測(cè)序策略：ATAC+轉(zhuǎn)錄組

研究結(jié)果與分析

一、斜帶石斑魚的人工性別逆轉(zhuǎn)以及性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中性腺的增殖檢測(cè)和胞凋亡的檢測(cè)

MT處理前，石斑魚仍處于初級(jí)生長(zhǎng)卵母細(xì)胞（PO）和皮質(zhì)肺泡期卵母細(xì)胞（PVO）豐富的階段（圖1a）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組石斑魚的性腺也保持在同一階段（圖1b、d、f）。相反，MT植入組的石斑魚從雌性變?yōu)樾坌?。在組織學(xué)上，MT植入后一周，性腺中的卵母細(xì)胞退化，新的生精囊腫增生，這被定義為性逆轉(zhuǎn)的早期階段（第1周；圖1c）。植入后三周，性腺進(jìn)入性逆轉(zhuǎn)中期，其特征是大量精原細(xì)胞（SG）和精母細(xì)胞（SCs）以及數(shù)量有限的卵母細(xì)胞（第3周；圖1e）。植入后5周，性腺進(jìn)入性逆轉(zhuǎn)后期，擁有大部分雄性生殖細(xì)胞，與自然睪丸相似（第5周；圖1g）。

為了研究MT誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中性腺中的增殖信號(hào)，采用免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。在對(duì)照組中，PCNA信號(hào)主要位于體細(xì)胞中（圖2a）。在性逆轉(zhuǎn)早期，在新發(fā)育的雄性生殖細(xì)胞中觀察到PCNA陽(yáng)性信號(hào)（圖2b）。在性逆轉(zhuǎn)中期，PCNA信號(hào)主要在男性生殖細(xì)胞中檢測(cè)到（圖2c）。在性逆轉(zhuǎn)后期，僅在SG和SC中觀察到信號(hào)（圖2d）。此外，作者采用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）來(lái)檢測(cè)卵母細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明，在正常卵巢中很難檢測(cè)到TUNEL信號(hào)（圖3a）。在性逆轉(zhuǎn)的早期，在一些卵母細(xì)胞和體細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性信號(hào)（圖3b）。在性逆轉(zhuǎn)中期，TUNEL陽(yáng)性信號(hào)更強(qiáng)，僅在卵母細(xì)胞中觀察到（圖3c）。在性逆轉(zhuǎn)后期，信號(hào)出現(xiàn)在幾個(gè)細(xì)胞中，這些細(xì)胞可能是體細(xì)胞或假陽(yáng)性信號(hào)（圖3d）。以上結(jié)果表明斜帶石斑魚在人工性別逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，卵母細(xì)胞發(fā)生凋亡，而雄性生殖細(xì)胞則出現(xiàn)增殖。

圖1+2+3人工性別逆轉(zhuǎn)以及性腺的增殖檢測(cè)和胞凋亡的檢測(cè)注：PO：初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞；PVO：皮質(zhì)肺泡期卵母細(xì)胞；SG：精原細(xì)胞；SC：精母細(xì)胞；ST：精細(xì)胞。

二、ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)果概述

作者聯(lián)合ATAC-seq和RNA-seq研究斜帶石斑魚在性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中可獲得的染色質(zhì)、基因表達(dá)譜以及它們之間的關(guān)系。斜帶石斑魚性腺組織被分為三組：MT植入一周（中間組I）、MT植入后五周（睪丸組T）和未植入MT（對(duì)照組C）。ATAC-seq數(shù)據(jù)顯示平均比對(duì)率為73.34%，每個(gè)樣品有12.7百萬(wàn)個(gè)合格片段（圖4b）。所有文庫(kù)片段長(zhǎng)度都如預(yù)期所示，包括大多數(shù)小片段（<200bp，為核小體間開放染色質(zhì)）和逐漸減少的大片段(≥200bp，系跨越核小體的開放染色質(zhì))（圖4c）。在ATAC-seq檢測(cè)到的假定易接近區(qū)域中，超過(guò)50%位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（TSS）上游2kb處，尤其是TSS上游1kb處的啟動(dòng)子，約32%位于遠(yuǎn)端基因間區(qū)域，其余18%位于基因體的內(nèi)含子、外顯子和基因下游（圖4d）。此外，確定的可接近區(qū)域大多富集在TSS的2kb范圍內(nèi)（圖4e），這與斜帶石斑魚這些區(qū)域中存在順式調(diào)控元件（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等）相一致。

研究發(fā)現(xiàn)ATAC-seq峰在幾個(gè)性別相關(guān)基因附近高度富集。hsd17b7（羥基類固醇（17β）脫氫酶7）附近的峰值在睪丸組中顯著富集，但在對(duì)照組和中間性組中未檢測(cè)到（圖5a）。ATAC分析發(fā)現(xiàn)在三個(gè)發(fā)育階段的性腺中檢測(cè)到4552個(gè)共同峰和無(wú)數(shù)特有的峰（圖5b）。轉(zhuǎn)錄組分析顯示在六個(gè)樣本中檢測(cè)到534個(gè)共有基因（圖5c），組間比較結(jié)果顯示：與中間性組相比，對(duì)照組中有1291個(gè)上調(diào)基因和7個(gè)下調(diào)基因；與睪丸組相比，對(duì)照組共檢測(cè)到2888個(gè)上調(diào)基因和326個(gè)下調(diào)基因；與中間性組相比，睪丸組有984個(gè)上調(diào)基因和843個(gè)下調(diào)基因（圖5d）。

三、差異可及區(qū)域中高度富集的已知基序及其靶基因

為了確定染色質(zhì)可及性差異的潛在驅(qū)動(dòng)因素，作者篩選出差異可及區(qū)域與組成性開放區(qū)域相比的前十個(gè)上調(diào)TF基序的富集情況，并列出了對(duì)照組與中間性組中前十個(gè)基序的富集和DNA序列（圖6a）。其中，*豐富的基序是ZNF263（鋅指蛋白263）、SPIB（轉(zhuǎn)錄因子）和RFX4（調(diào)節(jié)因子×4）。在可接近染色質(zhì)區(qū)域聚集的ZNF263全位點(diǎn)附近檢測(cè)到TF占用的相對(duì)清晰的足跡（圖6b）。ZNF263與基本細(xì)胞過(guò)程相關(guān)，很少有研究確定ZNF263在生殖方面的作用。該研究結(jié)果表明，ZNF263在性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中調(diào)用了大量的性相關(guān)基因，暗示ZNF263可能通過(guò)對(duì)其靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在性逆轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要作用。在*豐富基序的目標(biāo)基因中，許多基因與性逆轉(zhuǎn)相關(guān)，形成TF基因網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)許多TF結(jié)合基因參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和類固醇合成，包括zbtb16、dmrt1、sox11、star（類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白）和hsd17b7。為了說(shuō)明潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，作者在對(duì)照組和中間性組的比較中繪制了ZNF263、SPIB、ETV2及其靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖（圖6c）。

四、性別相關(guān)差異表達(dá)基因（DEG）的表達(dá)水平

研究發(fā)現(xiàn)已知的TFs基序以高度性別優(yōu)先的方式富集（圖7）。氣泡圖顯示了與性逆轉(zhuǎn)相關(guān)的30個(gè)DEG的富集和表達(dá)情況，這30個(gè)DEG對(duì)性腺發(fā)育和性調(diào)節(jié)至關(guān)重要，包括bmp15、cyp19a1、daz（l刪除活力缺乏精子）、dnd、dmrt1-3、foxl2、nanos2-3、piwil1和sox9。此外，基序出現(xiàn)的時(shí)間與相應(yīng)基因的表達(dá)一致。例如，MT植入5周后，dazl和dmrt2及他們結(jié)合的基序在性腺中強(qiáng)烈富集。研究還發(fā)現(xiàn)dnd、nanog、nanos3和SAL4在卵巢和雌性偏好的中間性腺中顯著性表達(dá)，而dmrt1、gas8、piwil1和star的表達(dá)水平在睪丸中顯著。

五、RT-qPCR驗(yàn)證數(shù)據(jù)推斷的DEG

在30個(gè)DEG中，對(duì)12個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，并分析性別逆轉(zhuǎn)期間基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，這些基因的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致。卵巢中bmp15、dnd、gdf9和nanog的表達(dá)顯著高于睪丸，并且在性逆轉(zhuǎn)期間其表達(dá)逐漸降低（圖8a、d、e、g）。睪丸中dmrt1、nr5a2、star（類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白）、sox9（性別決定區(qū)Y-box9）和rergl（ras相關(guān)和雌激素調(diào)節(jié)生長(zhǎng)抑制物樣基因）的表達(dá)顯著高于卵巢，尤其是MT植入后五周的性腺（圖8b、f、j、k、l）。

六、性相關(guān)基因的定位

用原位雜交（ISH）技術(shù)分析了不同性腺階段性相關(guān)基因（dazl、Dmrt1、star、rergl）的定位。dazlmRNA僅限于斜帶石斑魚的雌性和雄性生殖細(xì)胞（卵母細(xì)胞、SG和SC）表達(dá)（圖9a、b），結(jié)果表明dazl是一種生殖細(xì)胞標(biāo)記物，在睪丸中高表達(dá)，這與其他物種中dazl的表達(dá)一致。在自然雌性的卵巢中未檢測(cè)到Dmrt1信號(hào)（圖9d）。性逆轉(zhuǎn)后期的性腺有豐富的雄性生殖細(xì)胞SG、SC和ST，帶有dmrt1陽(yáng)性信號(hào)，而卵母細(xì)胞沒(méi)有dmrt1信號(hào)（圖9e），因此dmrt1可以被認(rèn)為是斜帶石斑魚的生殖細(xì)胞標(biāo)記。star作為合成類固醇激素途徑中的限速酶，其在雄性斜帶石斑魚的睪丸中特異表達(dá)，而在卵母細(xì)胞中未檢測(cè)到star信號(hào)（圖9g）。此外，發(fā)現(xiàn)starmRNA在SG、SC和ST中表達(dá)（圖9h）。rerglmRNA僅在雄性生殖細(xì)胞中檢測(cè)到（圖9j，k），這與RT-qPCR結(jié)果一致，暗示其在性別調(diào)節(jié)中的潛在作用。dazl、dmrt1、star和rergl的雜交探針作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示性腺中沒(méi)有信號(hào)（圖9c、f、I、l）。

七、根據(jù)性逆轉(zhuǎn)早期的RNA序列推斷ATAC-seq的核心峰

分析ATAC-seq和RNA-seq的相關(guān)性，以探索轉(zhuǎn)錄活性的變化，并捕獲性逆轉(zhuǎn)早期的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。圖10a列出了前20個(gè)KEGG富集途徑，如賴氨酸降解途徑、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)途徑等。在雌激素信號(hào)通路中，對(duì)照組與中間性組相比有17個(gè)DEG，比如gnas、grb2、esr2（雌激素受體β）等。在這些基因中，我們?cè)贏TAC-seq的相同比較結(jié)果中只發(fā)現(xiàn)了gnas的峰值，它位于通路的上游。gnas的峰值由ZNF263調(diào)節(jié)，這表明gnas染色質(zhì)的變化可能是觸發(fā)該通路中下游基因差異表達(dá)的核心基因。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂途徑中檢測(cè)到13個(gè)DEGs，包括PKA、SMC1和PGR等，然而，在ATAC-seq數(shù)據(jù)中僅發(fā)現(xiàn)ccnb2峰。在人工性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，參與類固醇激素生物合成的幾種酶，如HSD17B1和CYP19A發(fā)生了顯著變化。除CYP21A外，大多數(shù)DEG的表達(dá)均低于對(duì)照組（圖10b）。CYP21A是將類固醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)醇的關(guān)鍵酶，據(jù)報(bào)道，?？~的皮質(zhì)醇在性轉(zhuǎn)變期間表達(dá)達(dá)到峰值，這表明皮質(zhì)醇在性逆轉(zhuǎn)中起作用。然而，本研究結(jié)果表明雌激素和雄激素的合成受到抑制，而在人工誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，腎上腺皮質(zhì)酮的合成上調(diào)，這為斜帶石斑魚的性逆轉(zhuǎn)提供了新的見(jiàn)解。

總結(jié)

該研究首次采用高靈敏度的ATAC-seq方法對(duì)性逆轉(zhuǎn)期間的斜帶石斑魚進(jìn)行了開放性染色質(zhì)分析。這項(xiàng)技術(shù)可以定位潛在的基因調(diào)控區(qū)域。通過(guò)ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，我們確定了許多不同發(fā)育階的新的性別相關(guān)基因。對(duì)ATAC-seq鑒定的開放染色質(zhì)區(qū)域的進(jìn)一步挖掘揭示了重要TFs與下游基因的網(wǎng)絡(luò)，以及染色質(zhì)可及性的變化，這些變化可能在性逆轉(zhuǎn)中起重要作用。本研究為今后的研究提供了重要的數(shù)據(jù)集和多種新的研究途徑。

參看文獻(xiàn)：

XiWu,YangYangandChaoyueZhongetal.,IntegrationofATAC-seqandRNA-seqUnravelsChromatinAccessibilityduringSexReversalinOrange-SpottedGrouper(Epinepheluscoioides)[J].Internationaljournalofmolecularsciences,2020,21(8):2800