綜合方法揭示了三種東方煙草品種中突出代謝多樣性的關鍵轉錄本和代謝物

英文名稱: Comprehensive approaches reveal key transcripts and metabolites highlighting metabolic diversity among three oriental tobacco varieties

中文名稱: 綜合方法揭示了三種東方煙草品種中突出代謝多樣性的關鍵轉錄本和代謝物

雜志：Industrial Crops & Products 2020

影響因子： 4.244

研究背景

煙草(Nicotiana tabacum L.)是一種商業(yè)上重要的農(nóng)作物，在 12 個歐洲聯(lián)盟(歐盟)國家種植面積約 10 萬公頃，每年生產(chǎn) 20 萬噸干葉(歐洲聯(lián)盟委員會，2015 年)。希臘是歐洲第二大煙草生產(chǎn)的國家。在希臘栽培的煙草品種主要是東方煙（曬干）品種，主要特點是小的植株和葉片大小以及其獨特的芳香性。“Xanthi 81”, “Katerini 53”和“Smirni 3B”這三個品種的特點是它們的性質(zhì)不同，特別是它們的香氣和風味。對這三個品種的轉錄組學和代謝組學數(shù)據(jù)的整合提供了對可能影響重要煙草特征的遺傳背景的深入了解，并顯示了操縱這些途徑用于育種或生物技術目的的潛力。

材料方法

1、 實驗材料：“Xanthi 81”, “Katerini 53” 和 “Smirni 3B”

2、 研究方法：轉錄組；代謝組。

研究結果

1. 轉錄組分析

1.1“ Xanthi 81”和“ Katerini 53”中的差異表達（FPKM> 1）

基因在“ Xanthi 81”和“ Katerini 53”之間表達差異較大的基因為Nitab4.5_0000194g0060，該基因在“ Katerini 53”中的表達比“ Xanthi 81”高13.4 倍。與“Xanthi 81”相比，該基因在“ Katerini 53”中上調(diào)的事實表明，該品種可能具有多種反應機制。在兩個品種之間差異表達的另一個煙草基因 Ni?tab4.5_0000194g0070，推測其可能編碼另一個 T-葉綠素蛋白，但轉錄本似乎帶有終止密碼子，并且與 T-葉綠素 2b 不同（GenBank：BAJ25790.1）。兩個品種之間的第三大差異基因是編碼脂肪氧化酶的基因 Ni?tab4.5_0002164g0020。與編碼細胞溶解酶受體激酶 5（LYK5）的“ Xanthi 81”相比，“ Katerini 53”中的 Ni-tab4.5_0000525g0010 也顯著上調(diào)。最后一個基因是 Nitab4.5_0000363g0260；BLAST 結果表明被翻譯成 CP12-1 蛋白參與Calvin-Benson 循環(huán)。在煙草中，反義抑制 CP12 的表達對光合作用本身沒有很大影響。但是，反義表達載體的轉基因煙草的表型顯示出異常的葉片形態(tài)，生長，矮化和頂端優(yōu)勢減少。對這些煙草進行的進一步的轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，基因表達發(fā)生了輕微變化，但某些初級代謝酶，對脅迫做出響應的基因以及參與多胺代謝的基因發(fā)生了顯著變化，所有這些都表明 CP12 蛋白的作用更為復雜。

1.2. “ Xanthi 81”和“ Smirni 3B”中的差異表達（FPKM> 1）基因

與“ Xanthi 81”相比，“ Smirni 3B”和“ Katerini 53”中存在三種常見的過表達基因。除了 Nitab4.5_0001847g0020.1，另外兩個分別為編碼 LOX 2.1 和 CP12-1 蛋白質(zhì)的 Nitab4.5_0002164g0020.1 和 Nitab4.5_0000363g0260.1。煙草的CP12-1 同源物在兩者之間表達最多，在“Smirni3B”和“Katerini53”兩個品種中的表達值相同（199.9 vs 198），這表明 CP12 在“Xanthi 81”中低水平表達。目前煙草品種之間 CP12 的表達差異可能反映了生產(chǎn)力，植物防御力或任何其它尚未確定的途徑的差異，這些來可能對煙草育種產(chǎn)生巨大影響。

在 “Xanthi 81” 和 “Smirrni 3B” 之間差異表達大的一個基因是Nitab4.5_0000200g0190.1。推測參與 HGL-DTGs 生物合成相關。HGL-DTG 是非常重要的二萜，在幾種茄科物種中大量產(chǎn)生。與被抑制（FPKM = 13.6）的“ Xanthi 81”相比，該基因主要在“ Katerini 53”（FPKM = 80）和“ Smirrni 3B”（FPKM = 76.1）兩個品種中高表達。同時，在“ Katerini 53”和“ Smirrni 3B”中也顯著誘導了產(chǎn)生香葉基香葉基二磷酸（焦磷酸）（GGPP）的基因的同系物，GGPP是 HGL-DTG 生物合成的前體。共檢測到了三種 GGPP 合成酶。GGPPS1 主要在“ Katerini 53”（FPKM = 82.9）和“ Smirrni 3B”（FPKM = 89.3）表達，而在“ Xanthi 81”（FPKM = 40.6）中較低的表達。第二個幾乎在所有三個品種中平均表達，而第三個幾乎不表達。品種之間的這種差異可表明萜類化合物的產(chǎn)量存在差異。然而，在這項研究中，作者沒有關注生產(chǎn)的萜類。

2.GO 富集分析

對差異表達的基因進行 GO 富集分析。在生物過程類別中，主要與超氧化物酶代謝，精氨酸分解代謝，蘋果酸代謝和多胺生物合成有關。分子功能類別中的富集類別為硫氧還蛋白活性，固醇結合，L-蘇氨酸氨裂解酶活性和富馬酰乙酰乙酸酶活性。在細胞成分類別中，主要為高爾基體堆積，小亞基加工體，細胞外間隙和 1,3-β-D-葡聚糖合酶復合體。

3．苯丙素生物合成

在大多數(shù)植物中，苯丙烷的生物合成從 L-苯丙氨酸轉化為肉桂酸酯（或肉桂酸）開始，并形成多種多酚。其中有四分之二的在所有品種的葉片中均高表達，剩余的則表達較少。PAL1（Ni-tab4.5_0000754g0260.1）在所有品種中表達最高，其次是 PAL4（Nitab4.5_0000101g0270.1）。與其它兩個品種的葉子相比，在“ Katerini 53”中兩個 PAL 基因都檢測到高表達。而在結果中僅發(fā)現(xiàn)了一個低豐度肉桂酸基因（C4H），而該基因在“Katerini 53”中仍被上調(diào)。另一方面，有多個 CoA-連接酶（4CL）基因，除了其中兩個外，大多數(shù)基因低表達。Ni-tab4.5_0002394g0060.1 和 Nitab4.5_0001842g0060.1 在“Xanthi 81”葉片中均上調(diào)。這兩個基因可能是兩個不同的等位基因，因為它們與同一基因具有高度同源性（NCBI 基因 ID：107783543，草酸-CoA 連接酶類似）。這些基因有助于將苯丙氨酸轉化為 4-香豆基輔酶 A，這是一種重要的中間體，可作為下游許多產(chǎn)物合成的前體。HCT/HQT 和 C3H 這兩個基因參與了 CGA 的合成。在結果中后者幾乎沒有表達。但檢測到 3 個高表達的 HCT/HQT。其中兩個（Ni?tab4.5_0002724g0070.1 和 Nitab4.5_0002320g0020.1）是煙草 hqt 基因的不同等位基因（NCBI：NP_001312079）。兩者在“Xanthi 83”中均被上調(diào)。HQT優(yōu)選結合奎寧酸酯而不是草莽酸以產(chǎn)生 CGA。本氏煙草中 HQT 基因的過表達顯著提高了 CGA 的產(chǎn)量。第三個為 Nitab4.5_0001271g0010.1 是從煙草莖中純化的 HCT 基因（NCBI：NP_001312552），被發(fā)現(xiàn)可催化 CGA 和木質(zhì)素的合成，但是，該基因表達不足，品種間沒有明顯差異。

3.1．黃酮醇

查爾酮合酶（CHS）是類黃酮生物合成中的關鍵酶。研究者發(fā)現(xiàn)兩個 CHS基因在三個煙草品種的葉片中均低表達，因為 CHS 主要在花中組成性表達，但其表達主要是由非生物/生物脅迫誘導的。注釋為 CHS-1B 或 CHS2 的Nitab4.5_0002920g0060.1 在’Katerini 53’和’Xanthi 81’中略有上調(diào)，但第二個注釋為 III 型聚酮化合物合酶（NCBI：XP_016446648.1）差異很小。所有 CHI 基因也僅以低水平表達，在鑒定的結果中 F3H 也沒有差異。另一方面，鑒定了兩個參與黃酮醇形成的 FLS 基因。FLS1（Nitab4.5_0005357g0020.1）（NCBI：LOC107794305）的表達最高，而 NtFLS（Ni-tab4.5_0006276g0010.1）的表達低得多。這兩個基因在品種之間沒有差異表達。還檢測到有助于花色苷生物合成的基因，例如 DFR 和 ANS。DFR 中第一個僅適度表達，另外一個沒有差異。ANS（Nitab4.5_0003274g0110.1）幾乎未表達（圖 2）。蘆丁是一種黃酮醇糖苷，在花青素途徑生物合成，其中包括黃酮醇 3-O-葡萄糖基轉移酶和黃酮醇 3-O-葡萄糖苷胰島素轉移酶。結果表明低表達的 4 種黃酮醇 3-O-糖基轉移酶和 2種黃酮醇 3-O-糖苷胰島素轉移酶在“Smirrni 3B”和“Xanthi 81”比“Katerini 53”中表達更高、更多。

研究結果表明，在兩個 PAL 基因的表達中檢測到品種之間的顯株差異。與其它兩個基因相比，“Xanthi 81”中的基因表達不足，這可能意味著該品種中向CGA 的苯基-丙烷途徑的產(chǎn)物通量不同，因為當煙草中 PAL 過度表達時，PAL 活性及其含量顯著更高，其后的 CGA 濃度比蘆丁更高，這意味著更多的產(chǎn)物被轉移至該選擇性途徑。具有顯著較高的 CGA 含量的煙草植物中 PAL 含量的升高也與真菌感染的易感性降低有關。

4．代謝組分析

采集“Katerini 53”，“Xanthi 81”和“Smirrni 3B”葉片樣品，并使用氣相色譜GC-MS 和 LC-MS / MS 方法進行代謝分析。基因型預先鑒定為不同的色譜模式，共有 78 種代謝化合物（包括糖，氨基酸，有機酸）差異積累，如圖 3 所示。詳細的非靶向 GC-MS 代謝組學分析用于鑒定煙葉中產(chǎn)生的大多數(shù)主要代謝產(chǎn)物。在本研究中，所測得的最豐富的可溶性糖是果糖，葡萄糖，半乳糖和蔗糖。在果糖和蔗糖中檢測到統(tǒng)計學差異；“Katerini 53”中的果糖含量更高，而“Smierni 3B”中的蔗糖含量更高?！癒aterini 53”與其它兩個品種相比葡萄糖和半乳糖水平較高，差異無統(tǒng)計學意義。在可溶性醇中，兩個豐富的代謝產(chǎn)物是山梨糖醇和肌醇，但在品種之間未檢測到統(tǒng)計學上的顯著差異。這三個品種中的蘋果酸含量沒有任何統(tǒng)計上顯著不同?！癤anthi 81”葉子的氨基酸含量最高，但谷氨酸和 γ-氨基丁酸（GABA）除外。GABA 和脯氨酸是煙葉中的主要氨基酸。與其他兩個品種相比，“Smirrni 3B”中的 GABA 水平明顯更高。’Smirrni 3B’和’Xanthi 81’中的脯氨酸水平較高，而“Katerini 53”的脯氨酸水平最低。在“Smirrni 3B”中檢測到了高濃度的甘氨酸和絲氨酸這兩種必需氨基酸。煙草生物堿在根部合成，然后轉運到葉片。生物堿、尼古丁與植物抗草食動物防御有關。在三個品種中檢測到的尼古丁濃度在統(tǒng)計學上有顯著差異。結果表明，“Xanthi 81”的尼古丁濃度最高，而“Smirrni 3B”的尼古丁濃度最低。與“Katerini 53”相比，“Xanthi 81”中腐胺的含量有所降低，但其濃度仍高于“Smirrni 3B”。鑒定了所有擬參與煙草中尼古丁生物合成的相應基因，但僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾個在成熟葉片中表達。然而，基因 XS 和 QPT（三分之二）在“Xanthi 81”中表達較高。與其它兩個品種相比，這與“Xanthi 81”葉片中較高的尼古丁含量相關，這表明它可能是遺傳控制的。

總體而言，煙草多酚在這三個品種中差異很大。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果表明在三個品種之間多酚成分的含量存在顯著差異?！癒aterini 53”的 CGA，5-CGA 和 4-CGA 含量顯著更高，盡管對于后者的化合物，僅與“Smirni 3B”相比，差異才具有統(tǒng)計學意義。

如上所述，“Xanthi 81”中兩個 HCT/HQT 基因高表達，但與“Katerini 53”相比，其葉片中的 CGA 濃度較低。另一方面，HCT/HQT 基因的高表達可能由于前體的限制而導致更多的產(chǎn)物形成?！癤anthi 81”和“Smirrni 3B”中的香豆素衍生物，瑞香堿和莨菪堿等被下調(diào)。兩類主要的類黃酮，即黃酮和類黃酮，起著保護細胞免受 UVeB 輻射的作用，因為它們聚集在葉片的表皮層中，并在 UVeB 區(qū)域強烈吸收光。NAR 是一種黃烷酮，是所有下游類黃酮類（包括黃酮醇）的前體。“Smirni 3B”中 NAR 比“Xanthi 81”高出四倍。香草醛，一種低分子量的酚類化合物，具有抗氧化和抗微生物特性。在“Smirni 3B”中發(fā)現(xiàn)了高含量的香草酸和香草醛，分別比其它品種含量高 3.5 倍和 4.26 倍。先前的研究表明，HCHL 基因的轉基因煙草品系顯示 CGA 和蘆丁的消耗高達 93％和 82％，而以前無法檢測到的香草酸和香草醇的含量卻上升了。與這些結果相吻合的是，“Smirni 3B”中的香草醛和香草酸含量高，而 CGA，東莨菪素和蘆丁含量低。此外，“Smirni 3B”的咖啡酸含量比“Katerini 53”高 3 倍，并且含量也高于“Xanthi 81”，這些差異具有統(tǒng)計學意義?！癤anthi 81”中的蘆丁濃度較高，但僅與’Smirni 3B’相比具有統(tǒng)計學意義，在‘Katerini53’葉提取物中，主要的香豆素-東莨菪堿積累量較大。在三個品種中似乎僅黃素醇-3-O-葡糖苷胰島素轉移酶差異表達，這可能與僅在“Xanthi 81”和“Smirni 3B”中蘆丁各自濃度的差異有關。煙堿在“Xanthi 81”中檢出的濃度較高，但與其他兩個品種沒有顯著差異。