導(dǎo)讀
?大量數(shù)據(jù)表明，腸道菌群在人類健康和疾病的幾乎所有方面都發(fā)揮極其重要且深遠(yuǎn)的作用。然而，地球上的大量微生物都是“未經(jīng)培養(yǎng)的”，這對微生物組研究來說是一個重大挑戰(zhàn)。宏基因組分箱（Metagenomic binning）是一種將宏基因組測序得到的混合了不同生物的序列或contigs按物種起源和類別分開歸類的生物信息學(xué)分析方法，提供了一種不依賴培養(yǎng)的方法來克服各種自然生態(tài)位中“未培養(yǎng)的大多數(shù)”缺乏參考基因組的問題。
2023年1月5日，內(nèi)蒙古農(nóng)學(xué)大學(xué)張和平教授和孫志宏研究員團(tuán)隊(duì)在微生物領(lǐng)域國際期刊《Nature Microbiology》（IF：30.964）上發(fā)表了題為“A high-quality genome compendium of the human gut microbiome of Inner Mongolians（“內(nèi)蒙古人腸道菌群的高質(zhì)量基因組簡編”）的研究論文。該研究基于一項(xiàng)益生菌（Probio-M8）發(fā)酵乳人群干預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用混合長讀（ONT)和短讀HiSeq測序來表征60名內(nèi)蒙古人的糞便菌群，基于分箱的宏基因組分析策略和方法，構(gòu)建了內(nèi)蒙古人腸道高質(zhì)量基因組數(shù)據(jù)庫（IMGG）。百邁客為該研究提供了ONT宏基因組測序服務(wù)。
主要結(jié)果1、超深度宏基因組混合測序與組裝
研究者利用了之前進(jìn)行的一項(xiàng)基于生物標(biāo)記物的縱向人體試驗(yàn)，該試驗(yàn)調(diào)查了每天攝入益生菌酸奶(包含Bifidobacterium lactis?ProBio-M8，ProBio-M8)與普通酸奶相比的益處。隨機(jī)挑選了60名參與者在三個時間點(diǎn)(開始食用酸奶后0、7和28d)采集了180份糞便樣本，在PromethION 和HiSeq平臺上進(jìn)行了超深度測序，生成了3.7Tbps的三代數(shù)據(jù)和20.1Tbps的二代數(shù)據(jù)（即每個樣本20.5±4.5 Gbps和111.8±8.65 Gbps）。該混合超深宏基因組測序?qū)崿F(xiàn)了平均N50長度為278Kbps宏基因組組裝，平均總組裝長度為314Mbps。*長contig為6.77 Mbps，6688個contig大于1 Mbps。三代數(shù)據(jù)的質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了大多數(shù)現(xiàn)有的人類腸道三代數(shù)據(jù)庫，目前的三代數(shù)據(jù)庫中平均N50長度為8Kbps；平均reads長度為6 Kbps；平均reads質(zhì)量為9.5。
為了評估組裝流程的準(zhǔn)確性，研究者基于三種測序和組裝策略，直接從攝入益生菌酸奶的個體糞便樣本中組裝Probio-M8基因組：即僅三代序列組裝、二三代混合組裝、僅二代序列組裝。對于每種組裝方法，分別重建了50個Probio-M8基因組，并與Probio-M8參考基因組進(jìn)行比較。和預(yù)期一致，與單獨(dú)使用二代或三代測序構(gòu)建的基因組相比，二三代混合組裝的基因組在組裝連續(xù)性、堿基對和基因預(yù)測準(zhǔn)確性、基因組完整性、全基因組相似性度量以及功能注釋的精準(zhǔn)度等多個基因組質(zhì)量參數(shù)方面表現(xiàn)出了極大的提高 。此外，二三代混合組裝的基因組組裝錯誤率與二代數(shù)據(jù)覆蓋率呈負(fù)相關(guān)，但與測序深度無關(guān)。因此，二三代混合組裝是一種強(qiáng)有力的策略，可以直接從復(fù)雜的人類腸道宏基因組數(shù)據(jù)庫組裝環(huán)狀和更加準(zhǔn)確的基因組。
2、高效組裝種水平的CMAG
基于二三代測序混合組裝共獲得了802個CMAG，在準(zhǔn)備本手稿時，只有225個CMAG保存在公共基因組數(shù)據(jù)庫中。其中大多數(shù)(n=160)是從環(huán)境元基因組中重建的。該研究組裝的CMAG較大，從1.0 Mbps到5.5 Mbps(平均為2.4 Mbps)，這個范圍涵蓋了大多數(shù)已知腸道細(xì)菌的基因組大小。為了評估目前組裝的CMAG的代表性，按照平均核苷酸同源性(ANI)95%閾值進(jìn)行物種水平基因組去冗余，然后將該數(shù)據(jù)集與統(tǒng)一人類胃腸道基因組(UHGG)中去復(fù)制的基因組進(jìn)行比較?？偣脖Ａ袅?34個種水平的CMAG，涵蓋11個門、14個綱、27個目、45個科、94個屬(圖1A和補(bǔ)充表5)。其中有131個物種水平的CMAG是之前未報道的環(huán)狀的、完整、人類特有的各自物種的代表性基因組，65個未培養(yǎng)物種的參考基因組的質(zhì)量得到了改善。這些結(jié)果表明了當(dāng)前工作流程在從復(fù)雜的宏基因組數(shù)據(jù)集和組裝挑戰(zhàn)的區(qū)域組裝完整基因組方面的能力和有效性。
圖1.有效組裝大量物種水平的完整（環(huán)狀，無間隙）宏基因組組裝基因組
3、內(nèi)蒙古人高質(zhì)量腸道基因組數(shù)據(jù)庫
最初的bins是通過兩種裝箱方法(MetaBAT23和Vamb11)產(chǎn)生的，然后通過DASTool和內(nèi)部腳本進(jìn)行整合和改進(jìn)。連同上述CMAG，該研究總共還原了12,391個符合MIMAG標(biāo)準(zhǔn)中的中位質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的MAG(>50%完整性和<5%污染)。其中的6,729個MAG也滿足MIMAG標(biāo)準(zhǔn)高質(zhì)量定義(完整性>90%和污染率<5%，具有5S、16S和23S rRNA基因以及至少18個tRNA(TRNA)基因；稱為IMGG數(shù)據(jù)集)。
接下來，研究者對IMGG數(shù)據(jù)集中的6,729個MAG和從UHGG收集檢索到的147,835個高質(zhì)量基因組進(jìn)行聚類分析(圖2A)。聚類過程產(chǎn)生了485個宏基因組種(MGS)，其中至少包含一個IMGG。從分類上劃分為11個門、14個綱、30個目、40個科，橫跨220個屬(圖2B和補(bǔ)充表8)。
工作流程顯著提升了MAG的連續(xù)性(圖2C)，這從IMGG數(shù)據(jù)集中的contig數(shù)量顯著少于UHGG數(shù)據(jù)集中的N50長度或代表性基因組(重疊群數(shù)量；N50長度。此外，盡管UHGG數(shù)據(jù)集包含相當(dāng)多的MAG(n=111,744)，但只有5,053個MAG符合MIMAG標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而且其中大多數(shù)(n=4,058)是培養(yǎng)的分離物，這表明基因組質(zhì)量需要進(jìn)一步完善。另一方面，該研究為288個物種提供了具有代表性的高質(zhì)量MIMAG參考基因組，可用高質(zhì)量MIMAG的數(shù)量在154個物種中擴(kuò)大了50%以上，其中包括一些在UHGG目錄中具有較高代表性的物種，如Agathobacter rectalis、Alistipes putredinis、Bacteroides_B dorei和Lachnospira eligens_B(圖2D和補(bǔ)充表8)。
圖2.內(nèi)蒙古人腸道基因組IMGG數(shù)據(jù)庫是一個擴(kuò)展的基因組資源
4、提高腸道復(fù)雜基因組區(qū)域的分辨率
為了揭開復(fù)雜的腸道基因組區(qū)域（包括rrn、MGC、前噬菌體和IS），該研究將從IMGG數(shù)據(jù)庫組裝的485個MGS與UHGG數(shù)據(jù)庫中的對應(yīng)片段進(jìn)行了比較。正如預(yù)期一樣，與UHGG相比，IMGG有著更多的rrn拷貝（包括16S、23S和5S rRNA）（圖3a）；并且IMGG和NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的完整分離基因組的rrn拷貝數(shù)基本一致，這表明UHGG數(shù)據(jù)庫中MGS嚴(yán)重低估了的rrn基因拷貝數(shù)。此外，通過對全面的基因拷貝數(shù)數(shù)據(jù)庫（rrnDB）進(jìn)行分類搜索，其中85%（413/485）在當(dāng)前組裝的MGS是找不到的，包括一些16S基因拷貝數(shù)高的未培養(yǎng)MGS。這些結(jié)果表明，由于基因組質(zhì)量不足，目前可用的基因拷貝數(shù)參考數(shù)據(jù)庫在很大程度上仍然不完整。
研究者進(jìn)一步使用MGC預(yù)測工具gutSMASH，比較了IMGG和UHGG中MGC的完整度。結(jié)果表明，在UHGG中發(fā)現(xiàn)的mGCs有很大比例(56.5%)位于contig邊緣，可能是不完整的，而在IMGG中只有4.5%的比例較低(圖3B)。此外，在IMGG和UHGG數(shù)據(jù)集中分別發(fā)現(xiàn)了每個基因組具有6個和3個完整的MGC，這表明在IMGG中識別全長MGC方面有了實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)(圖3B)。包含MGC編碼序列的基因組比例在IMGG中顯著高于UHGG(圖3C)，特別是在幾個MGC類別中，包括非蛋白源氨基酸、芳香族和其它短鏈脂肪酸(圖3D)。值得注意的是，MGC區(qū)的基因組比例只與短讀基因組的組裝N50長度有關(guān)，而與IMGGs無關(guān)，這表明MGC識別和分配的有效性和分辨率受到短讀數(shù)據(jù)組裝連續(xù)性不足的限制。
與UHGG數(shù)據(jù)庫相比，IMGG數(shù)據(jù)庫中前噬菌體基因組的分辨率有了很大提升。該方法在95%的IMGG中都能檢測到前噬菌體序列（與UHGG（55%）相比）。IMGG和UHGG每個基因組編碼前噬菌體的平均數(shù)量分別為4個和1個。IMGG中的前噬菌體序列的連續(xù)性也較高，N50長度為37974 bp（UHGG中為31064 bp；圖3f）；IMGG中前噬菌體編碼區(qū)的基因組比例是UHGG的4.2倍（圖3g）。與UHGG相比，IMGG中的IS區(qū)域更加jing q，表現(xiàn)在在每個物種的IS區(qū)域總拷貝數(shù)（增加了三倍；圖3h）和IS編碼區(qū)域的基因組比例（增加了近四倍；圖3i）。IS類別中改善程度*高的是IS1380（與UHGG相比，改善了5.6倍），其次是IS5、IS1634和ISAS1（分別是5.5倍、5.5倍和5.3倍；圖3j）。
圖3.內(nèi)蒙古人腸道基因組增強(qiáng)遺傳元件的基因組分辨率
5、人類腸道微生物中高度多樣化和分化的 MGC
進(jìn)一步深入探索了可用的高質(zhì)量基因組中編碼的代謝潛力。分析了 UHGG 和 IMGG 數(shù)據(jù)集中的高連續(xù)性和高質(zhì)量基因組。共從15512個基因組中還原了97428個MGC區(qū)域，其中78675個是完整的，并被納入進(jìn)一步分析。這些完整的MGC屬于所有八個MGC類別，分布在58個MGC類型中。*常見的類別是SCFA（40.0%），其次是Putative（28.9%）和E-MGC（17.2%）。然后，門水平分布和聚類分析揭示了MGC類別的總體分布在門水平的顯著差異（圖4a），以及在十個主要的門之間，它們在不同門中的數(shù)量各不同（圖4a）。此外，基于涵蓋九個主要門的功能性MGC分類分布的特異性聚類表明，MGC概述和組成在門水平間存在顯著差異，這些未培養(yǎng)物種中的一些最近發(fā)現(xiàn)了以前未報告的Christensenellales和Oscillospirales分類群，突出了這些代表性不足的分類群在促進(jìn)宿主健康方面的潛力（圖4c）。
約12%的MGC具有多個核心功能域?；旌螹GC顯著大于單一功能域MGC(P<2×10?16；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4A)。普遍的混合MGC組合是丁二酸酯和紅細(xì)菌固氮(RNF)復(fù)合體。大的混合MGC大小為117Kbps。它含有5個MGC功能結(jié)構(gòu)域，其中兩個屬于E-MGC和SCFA-其他類(分別屬于RNF復(fù)合體和乙醇胺利用途徑)，占MGC總長度的80%以上。這些數(shù)據(jù)表明，腸道微生物組MGC編碼了廣泛的代謝潛力，不同關(guān)鍵的人類腸道分類群的代謝潛力差異很大。這項(xiàng)研究為系統(tǒng)揭示人類腸道代謝潛能提供了起點(diǎn)。
圖4 人腸道菌群中代謝基因簇庫概述
6、2834個腸道前噬菌體的分類和功能注釋
噬菌體是另一組被低估的腸道微生物群。因此，研究者進(jìn)一步挖掘了 IMGG 數(shù)據(jù)集以尋找未知的腸道噬菌體。從 IMGG 數(shù)據(jù)集中還原了總共 21,217 個前噬菌體基因組，通過應(yīng)用未培養(yǎng)病毒基因組 (MIUViG) *低信息標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步聚類為 13,437 個物種水平病毒操作分類單元（vOTUs）。這些 vOTU 代表 39,839 Kbps N50 長度。
通過與宏基因組腸道病毒（MGV）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，對vOTU進(jìn)行分類。值得注意的是，95.5%（n=12834）的vOTU與MGV數(shù)據(jù)庫在物種水平不具有同源性。除了那些可分類到物種水平（4.5%）的病毒外，90.9%的vOTU與MGV水平具有科水平的同源性，但只有46.7%的病毒被分類到已知的病毒科（圖5a）。進(jìn)一步分析表明，常見的細(xì)菌宿主是Firmicutes_A（71.4%），這也是先前未報告前噬菌體的主要宿主。Siphoviridae和Myoviridate都是人類腸道中的優(yōu)勢前噬菌體科，其宿主范圍廣泛，涵蓋多個門（圖5c）；然而，Siphoviridae（Firmicutes_A [68.8%]，Bacteroidota [15.58%]，Actinobacteriota [5.3%]）和Myoviridae [Firmicuters_A[83.0%]）的主要細(xì)菌宿主在門水平的分布卻有很大差異。如預(yù)期那樣，crAssphage的宿主范圍小且具有特異性，僅由擬桿菌屬組成。
接下來，對IMGG數(shù)據(jù)庫中的前噬菌體基因組進(jìn)行深入分析，以探究其功能能力。從12834個物種水平的vOTU代表性基因組中鑒定出596193個蛋白質(zhì)編碼基因，并將這些假定基因與幾個常見的功能和/或病毒注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，僅有55.4%的前噬菌體基因在功能上能夠被分類，而44.6%的基因與任何交叉比較的數(shù)據(jù)庫都不具有同源性，被分配給了未知的功能（圖5d）。這些結(jié)果表明，盡管攜帶ARG的噬菌體很少存在于腸道微生物中，但這些噬菌體可能編碼ARG（例如，A163.CMAG_1_1_7_59800編碼假定的β-內(nèi)酰胺酶基因；圖5h），可能成為ARG轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵載體，并對人類健康造成嚴(yán)重威脅。這些結(jié)果表明，腸道前噬菌體在分類和功能上比先前我們所了解的更加多樣化。
圖5 腸道中前噬菌體和插入序列的概述
總 結(jié)
在該項(xiàng)研究中，使用混合長讀長 PromethION 和短讀長 HiSeq 測序?qū)?60 名內(nèi)蒙古人（三個時間點(diǎn)， 180 個樣本）的糞便微生物群進(jìn)行了表征。構(gòu)建了 IMGG 數(shù)據(jù)庫，其中包含 802 個環(huán)狀基因組和 5,927 個符合 MIMAG 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的高質(zhì)量基因組標(biāo)準(zhǔn)的高質(zhì)量基因組，極大地擴(kuò)展了當(dāng)前人類腸道高質(zhì)量 MIMAG 數(shù)據(jù)庫（n = 7,492）。此外，該 CMAG 基因組數(shù)據(jù)集，是目前可用 CMAG 的三倍多。因此該研究構(gòu)建的IMGG 數(shù)據(jù)庫是一個有價值的基因組資源。
內(nèi)蒙古農(nóng)學(xué)大學(xué)張和平教授和孫志宏研究員為該論文通訊作者，第一作者為食品科學(xué)與工程學(xué)院2018級博士研究生靳昊，2022級博士研究生全柯諭和何秋雯助理研究員為共同第一作者。
參考文獻(xiàn)
Jin H, Quan K, He Q, et al. A high-quality genome compendium of the human gut microbiome of Inner Mongolians. Nat Microbiol. 2023;8(1):150-161. doi:10.1038/s41564-022-01270-1
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