現(xiàn)如今，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究范圍幾乎覆蓋全部的研究領(lǐng)域，包括農(nóng)林領(lǐng)域，畜牧業(yè)，海洋水產(chǎn)，生物醫(yī)藥，環(huán)境科學(xué)，已經(jīng)成為生物科技研究的必備利器。轉(zhuǎn)錄組學(xué)在農(nóng)學(xué)領(lǐng)域有五大黃金應(yīng)用方向：生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)、免疫互作、突變表型、品質(zhì)研究，其中生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)研究項(xiàng)目所占比例最多。隨著三代全長測序技術(shù)的出現(xiàn)（如PacBio），轉(zhuǎn)錄組研究內(nèi)容變得豐富多彩。通過全長轉(zhuǎn)錄組測序，我們不僅可以獲得全長序列，還可進(jìn)行可變剪切、APA、融合基因，新基因的研究，大大豐富了研究內(nèi)容，提高了論文的質(zhì)量。
對于無參物種、基因組組裝或注釋不完善的物種，用普通的二代無參轉(zhuǎn)錄測序，我們將會獲得不好的轉(zhuǎn)錄本序列信息，注釋和定量結(jié)果。對于這種情況，我們可以采用PacBio單樣本全長轉(zhuǎn)錄組方案設(shè)計(jì)模式，利用三代獲得全長轉(zhuǎn)錄本庫，作為二代數(shù)據(jù)的參考基因組使用，大大提升了數(shù)據(jù)質(zhì)量。接下來小編給大家解讀兩篇鯉魚應(yīng)對脅迫反應(yīng)機(jī)制的成功案例，從實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，分析內(nèi)容，發(fā)表文章IF分?jǐn)?shù)，我們可以充分了解到三代PacBio測序的優(yōu)勢。
英文標(biāo)題：IntegrativeTranscriptomicAnalysisRevealstheImmuneMechanismfora CyHV-3-ResistantCommonCarpStrain
中文標(biāo)題：轉(zhuǎn)錄組分析揭示CyHV-3抗性鯉魚品系的免疫機(jī)制
發(fā)表雜志：Frontiersinimmunology.2021
影響因子：7.561
合作單位：中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所
DOI：10.3389/fimmu.2021.687151
材料：德國鏡鯉G4：CyHV-3抗性篩選后的第四代，G4（實(shí)驗(yàn)組）和非抗病育種品系（對照組）用于病毒脅迫。
實(shí)驗(yàn)方法：將患病魚內(nèi)臟勻漿溶液添加到水箱中，從而誘導(dǎo)CyHV-3感染兩個(gè)品系。
測序策略：Illumina測序：實(shí)驗(yàn)組和對照組分別取病毒刺激后第0天和第7天，獲得前腎樣本，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。PacBio全長測序：取肝臟、脾臟和腎臟的混合物，各兩生物學(xué)重復(fù)。
轉(zhuǎn)錄組分析的策略
研究背景
鯉魚皰疹病毒-3（CyHV-3）感染是鯉魚養(yǎng)殖的主要威脅，可導(dǎo)致鯉魚大量的死亡。CyHV-3可通過削弱宿主的免疫系統(tǒng)而使其死亡，導(dǎo)致其對病原微生物易感性，并可能在感染后6至10天內(nèi)出現(xiàn)發(fā)病和死亡。感染CyHV-3后存活下來的鯉魚可以抵抗這種病毒未來的感染。由于CyHV-3在鯉魚中存在潛伏期和持續(xù)性攜帶期，遺傳背景對于了解對病毒的耐藥性至關(guān)重要。德國鏡鯉品系G4是中國廣泛栽培的鯉魚品系，但因CyHV-3病毒引起高死亡率。然而目前在研究抗CyHV-3免疫機(jī)制的詳細(xì)免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)方面，還缺乏系統(tǒng)的研究。最近的研究表明，lncRNAs在不同類型病原體感染時(shí)的廣泛差異表達(dá)，表明lncRNAs在魚類免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。然而，在CyHV-3感染期間，鯉魚體內(nèi)的特異性LncRNA對免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)尚未被研究。第三代測序（如PacBio）可以解碼比第二代測序方法（如Illumina）更長的基因序列，包括mRNA和非編碼RNA在內(nèi)的更高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本組裝，可能提供對遺傳抗性機(jī)制的更詳細(xì)理解。在本研究中，為了揭示鯉魚抗CyHV3育種中涉及的免疫機(jī)制，使用圖1所示的策略，對CyHV-3激發(fā)期間的mRNA和長非編碼RNA（lncRNA）進(jìn)行了整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。對來自繁殖品系或非繁殖品系的存活鯉魚和健康對照鯉魚的免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了分析。
研究內(nèi)容
在CyHV-3感染后第0天和第7天提取鯉魚頭腎組織，并通過Illumina和PacBio測序分析轉(zhuǎn)錄組。在對涉及的GOterm和KEGG途徑進(jìn)行分析。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析用于揭示lncRNA對免疫基因的調(diào)節(jié)。結(jié)果表明，繁殖鯉魚品系通過一種特定的先天免疫機(jī)制對CyHV-3感染產(chǎn)生了顯著的抗性,主要的生物學(xué)過程是自噬、吞噬、細(xì)胞毒性和凝集素和MUC3阻斷病毒。此外，還有免疫抑制信號途徑，如IL21R對STAT3的抑制，PI3K介導(dǎo)的感染時(shí)多巴胺對炎癥的抑制，以及NLRC3在穩(wěn)定狀態(tài)下對STING的抑制。從非抗性品系中還發(fā)現(xiàn)了CyHV-3的可能易感因素，如ITGB1、TLR18和CCL4。本研究結(jié)果還表明，LncRNA調(diào)節(jié)的Nramp和PAI分別促進(jìn)病毒感染和感染細(xì)胞的增殖，而T細(xì)胞白血病同源框3(TLX3），以及l(fā)ncRNA的半乳糖凝集素3可能在抗病制中發(fā)揮作用。因此，免疫遺傳不敏感或易受CyHV-3感染的免疫因子已被揭示。
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