植物組織的采集及處理
被子植物6大器官模式圖
1、在與研究目的不沖突的前提下，盡量選取新鮮、幼嫩、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組織部位。植物組織越幼嫩新鮮所含的次生代謝產(chǎn)物就越少，隨著植物組織的逐漸成熟，次生代謝產(chǎn)物的含量會(huì)逐漸增多，而次生代謝產(chǎn)物的存在會(huì)影響核酸的提取效果，次生代謝產(chǎn)物越多，核酸提取越困難，得率也越低。
2、如果植物組織表面污漬較多，在采集之前應(yīng)迅速用預(yù)冷的純凈水或75%乙醇擦拭或沖洗干凈，再用吸水紙吸干組織表面殘留液體。
3、將處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中。
4、建議10min中內(nèi)（越快越好）置于液氮中冷凍1h以上，然后轉(zhuǎn)移至-80℃長(zhǎng)期保存，干冰運(yùn)輸。
動(dòng)物組織的采集及處理
1、液氮速凍法詳細(xì)流程:
1）提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以內(nèi)）
2）活體取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織等非研究所需的組織類型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈；
3）迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈
4）如果組織體積較大，將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>
5）將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號(hào)。
6）立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存
7）干冰運(yùn)輸。
2、TRIzol法(僅限于RNA類產(chǎn)品):
1）如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請(qǐng)務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，然后溶于 TRIzol 中組織樣品切勿過(guò)量；
2）震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送。
3、RNAlater??Tissue Collection保護(hù)液法(僅限于RNA類產(chǎn)品):
1）用RNAlater??Solution保存組織之前，需要將組織切割成長(zhǎng)寬高均≤ 0.5 mm的小塊。
2）如果組織帶血液或其他體液，需要過(guò)夜后更換一次RNAlater??Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過(guò)夜（使Solution充分浸潤(rùn)組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存；
3）RNAlater??Solution 不會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater??Solution中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來(lái)的保存液中繼續(xù)保存；
4）保存于RNAlater??Solution中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會(huì)結(jié)凍，但可能會(huì)有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會(huì)結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存；
5）一般來(lái)講，生物樣本保存于RNAlater??Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個(gè)月，-20 °C 或-80 °C 可長(zhǎng)期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater??Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存。
微生物樣品的采集及處理
細(xì)菌
注意：所有菌類樣品必須分離好菌體或菌絲送樣，切勿連帶培養(yǎng)基一起寄送，帶培養(yǎng)基的菌體無(wú)法提取。
1）顯微鏡下觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，盡量收集生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌。
2）將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無(wú)菌，無(wú)核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min。
3）棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時(shí)間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存。
4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸。
真菌
真菌的形態(tài)多樣，一般分為單細(xì)胞和多細(xì)胞真菌，酵母菌屬于單細(xì)胞真菌，而霉菌和蕈菌（大型真菌）都屬于多細(xì)胞的真菌。
單細(xì)胞真菌
單細(xì)胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1×107個(gè)，以 5×106-1× 107個(gè)為宜。您要做的項(xiàng)目要求送樣量較大時(shí)，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨(dú)保存。
1）顯微鏡下觀察酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)，盡量收集生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)期的酵母菌。
2）將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無(wú)菌，無(wú)核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。
3）棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時(shí)間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存。
4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸
細(xì)胞樣品的采集及處理
貼壁細(xì)胞
一次提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1 X 10^7 ?個(gè)，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?個(gè)為宜，可以將細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運(yùn)輸。
1、從培養(yǎng)箱中取出貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，確定生長(zhǎng)狀態(tài)良好（正常細(xì)胞融合度在80 %左右）;
2、棄去培養(yǎng)基，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中加入 5mL PBS（RNase free）， 清洗一次后棄盡PBS；
3、加入1mlPBS（RNase free）重懸后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；
4、離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速3000g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，置于液氮中速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。
離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol；細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。
液氮速凍法：
離心收集的細(xì)胞直接液氮速凍，速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。
懸浮細(xì)胞
一次提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1 X 10^7 ?個(gè)，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?個(gè)為宜，可以將細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運(yùn)輸。
1、確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速3000g為宜）；
2、棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；
3、離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速3000g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，置于液氮中速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。
TRIzol 裂解法（僅限于RNA類產(chǎn)品）：
離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol；細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。
*注：判斷裂解液加入量是否合適的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)細(xì)胞溶解物的黏度來(lái)判斷。在細(xì)胞剛?cè)芙鈺r(shí)，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會(huì)消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過(guò)少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)加裂解液。裂解液加入量過(guò)少，會(huì)導(dǎo)致抽提的 RNA 降解。
收集的細(xì)胞直接液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。
全血樣品的采集及處理
RNA類全血樣品制備
1、采血管選擇
采集血液進(jìn)行檢測(cè)面臨的一個(gè)主要問(wèn)題就是細(xì)胞內(nèi) RNA 的不穩(wěn)定性，RNA 在采血后數(shù)小時(shí)內(nèi)便會(huì)迅速降解。此外，某些種屬的 RNA 在采血后會(huì)通過(guò)基因誘導(dǎo)在體外增加。體外RNA 降解和基因誘導(dǎo)均可導(dǎo)致體內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目低估或高估。
BD 公司的 PAXgene 血液 RNA 管內(nèi)含能夠穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的添加劑，它能夠減少體外 RNA 的降解，并將基因誘導(dǎo)的水平降低到最小程度，適用于人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物全血樣品制備，對(duì)于全血樣品，我們只推薦使用此管送樣。
BD PAXgene 血液 RNA 管（貨號(hào) 762165）
2、采集血液
使用PAXgene血液RNA管前請(qǐng)仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，以便進(jìn)行正確的操作。如果PAXgene血液 RNA 管為唯一的抽血管，則將血液抽入 PAXgene 血液 RNA 管之前應(yīng)先抽血入“廢棄管”內(nèi)，使抽血過(guò)程中所用的采血器內(nèi)能被血液預(yù)灌注；否則 PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再?gòu)某轴樒魃先∠略嚬埽≒AXgene 血液 RNA管內(nèi)的負(fù)壓設(shè)計(jì)可向管內(nèi)抽 2.5ml 的血）。
采血后應(yīng)立即將 PAXgene 血液 RNA 管輕輕地顛倒 8-10 次，以確保管內(nèi)保護(hù)劑和血液充分混合均勻。
3、保存、運(yùn)輸
將 PAXgene 血液 RNA 管豎直置于室溫（18-25℃）靜置 2-24 小時(shí)，之后可貯藏于-20℃或更低溫度；若試管要貯藏于低于-20℃的溫度，先在-20℃冷凍 24 小時(shí)，然后再將其轉(zhuǎn)移到-70℃或-80℃，可保存至少 50 個(gè)月。大體積干冰運(yùn)輸。
DNA類全血樣品制備
1、用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2、上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中，轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）
3、干冰運(yùn)輸
注：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎
制備常見(jiàn)問(wèn)題匯總
組織保存管的選擇
所有組織樣品務(wù)必根據(jù)質(zhì)量多少選擇使用下圖的螺紋管保存，嚴(yán)禁直接裝入密封袋或錫箔紙（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存
組織送樣量要求
建議送樣量適用于95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如植物果實(shí)、根等。送樣量過(guò)少或過(guò)多均不利于提取實(shí)驗(yàn)，下限為建議量的一半，上限為建議量的3倍。隨著技術(shù)發(fā)展，當(dāng)前大部分產(chǎn)品建庫(kù)起始量較低，不需要太多組織，采樣量過(guò)多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)。
1、RNA類產(chǎn)品建議組織送樣量
2、二代DNA類產(chǎn)品建議組織送樣量
3、三代DNA類產(chǎn)品建議組織送樣量
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