微生物多樣性在水環(huán)境中的應(yīng)用：微生物多樣性測序結(jié)合qPCR揭示人糞便污染對水體影響

2022年9月30日，南開大學與山西醫(yī)科大學、常州大學合作在JCR Q1區(qū)《Journal of Hazardous Materials》（IF：14.224）發(fā)表題為“Unraveling the influence of human fecal pollution on antibiotic resistance gene levels in different receiving water bodies using crAssphage indicator gene ”的研究論文，該研究檢測了人類糞便和一系列受人類糞便影響的相關(guān)水體中抗生素耐藥基因(ARGs)、人類糞便污染指示基因crAssphage和抗生素的共存情況，結(jié)果表明，68.2%的研究水體中檢測到了crAssphage，證實了普遍存在的人類糞便環(huán)境污染。ARGs和crAssphage豐度都表現(xiàn)出從排放源（污水處理廠）到受納水體的距離衰減效應(yīng)。供試受納水體中ARG的豐度與人類糞便污染指示基因crAssphage豐度顯著相關(guān)，與抗生素殘留濃度不相關(guān)，證明了大量排放的人類糞便污染對受納水體ARGs的環(huán)境污染起到關(guān)鍵影響。該研究對明晰受人類糞便污染影響的水體中ARGs的污染特征和來源提供了重要見解。

發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials IF：14.224

發(fā)表時間：2022.09.16

研究背景

環(huán)境中細菌的抗生素耐藥性由于與臨床病原體的抗生素耐藥性密切相關(guān)而受到越來越多的關(guān)注。自從人類在臨床上使用抗生素以來，環(huán)境中的抗生素耐藥基因(ARGs)亦有所增加。然而，這種增加是否直接來源于環(huán)境殘留抗生素的選擇性壓力還是來源于人類大量排放的糞便污染卻不得而知。在該項研究中，調(diào)查了人類糞便以及受人類糞便污染影響的不同污水處理廠受納水環(huán)境中的 ARGs、crAssphage 和抗生素殘留特征，以期了解抗生素的選擇壓力和人類糞便污染對受納水體ARGs污染的影響。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1.人類糞便和水環(huán)境中 ARGs 的污染特征

運用高通量qPCR方法從采集的樣本中檢測到89個ARGs和5個MGEs。在所有檢的基因中，只有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶編碼基因blaTEM在所有樣本中都被檢測到。在>80%的樣品中檢測到strB、ermF、aadA1等ARGs(圖1A)。在所有采集的人糞便中檢測到28種ARGs，包括tetW、 cfxA、 tetO-01、tet(32)、blaTEM-1等，而在所有水樣中僅檢測到strB和blaTEM-1(圖2)。此外，比較了不同的環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在人類糞便和水中檢測到38個ARGs(圖3S1B)?？傮w而言，人糞便的ARG相對豐度顯著高于所有水樣。

ARG多樣性也隨著水從污水處理廠向自來水的輸送而減少(1C)。所有樣本的ARG譜的PCoA表明，不同類型的樣本包含顯著不同的ARG成分。從環(huán)境樣品中分離出人類糞便中的ARGs(圖1D)，表明腸道具有獨特的ARG圖譜。這可能是因為與環(huán)境相比，腸道的條件不同。來自污水處理廠和受納河水的樣品聚在一起較近，證實了污水處理廠出水的排放對受納河中的ARGs有很大影響。同樣，湖泊和自來水更傾向于聚集在一起，與所研究的湖泊都是自來水水源一致。上述結(jié)果表明，在所研究的樣品中普遍存在ARGs，污水處理廠攜帶的ARGs可能污染不同的受納水體。

2.人類糞便污染對水環(huán)境中 ARGs 的貢獻

借助人類糞便指示劑 crAssphage (CPQ_056)，分析了人類糞便排放對當?shù)厮h(huán)境中ARGs的影響。結(jié)果表明，crAssphage在所有環(huán)境樣品中的檢測頻率為 68.2%，相對豐度范圍為2.68×10-6至1.96×10-2每個16S rRNA基因拷貝（圖2），表明超過一半的水樣（湖水、自來水、污水處理廠和受納河水）被人類糞便污染。與 ARGs 一致，平均crAssphage 豐度也沿著水流從污水處理廠不同處理單元的污水到受納河水再到湖泊水體的順序逐漸減少（圖2）。這再次證明了人類糞便污染從污水處理廠的排放源到接收環(huán)境有著隨距離不斷衰減的效應(yīng)。

進一步的統(tǒng)計分析探討糞便污染對不同水體中 ARGs 的影響。Spearman相關(guān)性分析表明，總ARG相對豐度與crAssphage的豐度呈正相關(guān)（圖3A）。進一步分析表明，crAssphage 豐度同樣與某些 ARG 的豐度顯著相關(guān)，例如氨基糖苷類、FCA、MLSB、其他/外排、四環(huán)素和磺胺抗性基因（圖3B-F，表S5）。14 種ARG亞型和ermF與 crAssphage 顯著相關(guān)。更重要的是，這些 ARGs 亞型也同時在人類和水環(huán)境中檢出，表明它們可能源自人類糞便并被輸送到受納水體。

此外，人類糞便樣本中ARGs豐度與 crAssphage豐度之間沒有相關(guān)性，證實了腸道里 ARGs 豐度與crAssphage 豐度無關(guān)。這對 crAssphage作為人類糞便污染的指示基因至關(guān)重要。因此，上述環(huán)境樣本中ARGs 與 crAssphage 豐度之間的顯著正相關(guān)表明供試受納水體中 ARGs 的富集在很大程度上可歸因于人類糞便污染。

除了crAssphage 之外，研究者通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析了來自所有樣品的氨芐青霉素抗性菌株中的 blaTEM-1基因序列（圖4）。結(jié)果表明，來自四種環(huán)境樣品（湖水、自來水、污水處理廠和受納河水）的blaTEM-1與腸道樣品的進化關(guān)系密切（圖4）。該結(jié)果表明blaTEM-1可能通過污水排放在人類糞便和受納水體之間進行傳播。然而，需要進一步的研究來驗證這些發(fā)現(xiàn)。

3.水環(huán)境中的 ARGs 豐度與抗生素殘留無關(guān)

研究者進一步測量了抗生素殘留，結(jié)果表明，在所有五組中均檢測到四環(huán)素類、喹諾酮類和硝基呋喃類抗生素。污水處理廠樣品中17種抗生素的檢出頻率高于其他組，占 41.2%~64.7%。同時，在水環(huán)境中，污水處理廠的抗生素總濃度也高（289.5±236.7 ng/L），其次是受納河水（169.8±104.9 ng/L）。自來水在所有樣品中的抗生素殘留濃度低 (54.7 ± 51.0 ng/L)（表1）。人類糞便中的總抗生素濃度為 17.7±9.2 ng/g。由于糞便提供者在過去六個月內(nèi)都沒有用藥史，因此在人類糞便中檢測到的抗生素可能來自飲用水或食物。此外，在所研究的人類糞便中檢測到某些合成獸用抗生素，如磺胺氯噠嗪和恩諾沙星，也支持了這一結(jié)論。對水生環(huán)境中殘留的抗生素和 ARGs 進行了相關(guān)性分析。與 crAssphage 不同，抗生素濃度與 ARG 豐度之間沒有相關(guān)性。這一結(jié)果表明抗生素的選擇并不能主要解釋供試水環(huán)境中 ARGs 的豐度。綜上所述，ARGs 和抗生素之間沒有相關(guān)性，但卻顯著相關(guān)于crAssphage豐度，表明供試受納水體中 ARGs 的豐度在很大程度上可以用人類糞便污染的程度來解釋，本研究并沒有觀察到明顯的抗生素選擇ARGs現(xiàn)象。

4.細菌群落特征及其與ARGs的相關(guān)性

在人類糞便中，厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門和放線菌門是優(yōu)勢門(圖5A)。厚壁菌和擬桿菌占腸道菌群總數(shù)的(83.5±9.8)%，環(huán)境樣品中以變形桿菌和擬桿菌為主，變形桿菌所占比例高。在屬的水平上，人類的腸道Bacteroides，F(xiàn)aecalibacterium，Bifidobacterium， 和Subdoligranulum.Pseudomonas，而水環(huán)境中的優(yōu)勢屬為Flavobacterium，Arcobacter和Massilia(圖5B)。

細菌群落多樣性分析表明，除自來水外，其他水環(huán)境樣品的平均Shannon指數(shù)均高于人類糞便樣品(圖5C)。PCoA分析表明，人類糞便和環(huán)境樣本之間的細菌群落組成有顯著差異(圖5D)。然而，在人類糞便和水環(huán)境中存在著167個OTUS屬121個常見細菌屬，此外，還發(fā)現(xiàn)ARGs與所有樣品中的細菌群落顯著相關(guān)(圖3A)，這表明細菌群落組成決定了ARG組成，這一現(xiàn)象在各種環(huán)境中都被廣泛觀察到。

在該研究中，84個ARGs、5個MGES和20個細菌門被用來進行網(wǎng)絡(luò)分析(圖6B)。Chlamydiae和Dependentiae 與11種不同的ARG顯著相關(guān)，表明它們的基因組中可能含有多種ARG類型。四環(huán)素耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB和氨基糖苷類耐藥基因aacA/aphD是四環(huán)素耐藥基因的潛在宿主。Elusimmicrobia可能是aadE、blaCTX-M-02、Olec和vanRA-01的宿主。Synergistetes 可能是tetW、IS613和catA1的潛在宿主。由于該網(wǎng)絡(luò)是建立在相關(guān)性的基礎(chǔ)上，觀察到的ARGs潛在細菌宿主仍需進一步的試驗驗證。

總結(jié)

這項研究主要表明，人類排泄物對受污水處理廠影響的受納水體中的ARGs有顯著的影響。ARG和crAssphage豐度都表現(xiàn)出從排放源到受納水體的距離衰減效應(yīng)。人類糞便中的blaTEM-1基因與水環(huán)境中的blaTEM-1基因具有密切的進化關(guān)系。在被人類糞便污染的環(huán)境中，糞便污染可能是ARG污染的主要來源。抗生素殘留濃度與ARGs豐度之間無顯著的相關(guān)性，表明環(huán)境殘留抗生素選擇產(chǎn)生ARGs的現(xiàn)象并不明顯。該研究促進了公眾對人類影響環(huán)境中人類糞便污染對抗生素耐藥性的影響的理解。

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