動物細胞圖譜分析繪制方法：單細胞轉錄組測序技術

長久以來，生命科學的研究主要基于群體細胞水平的分析，隨著單細胞組學技術的出現(xiàn)，使我們能夠從單個細胞水平，以前所有未的分辨率去解析其他組學掩蓋掉的細胞異質性難題和低豐度表達的分子等信息。如今，越來越多從事動物領域研究的科研工作者，開始利用單細胞測序技術來進行動物細胞圖譜、生長發(fā)育、再生機制、神經(jīng)科學、生物進化、免疫感染等方面的研究。

本次我們給大家?guī)韮善脝渭毎D錄組技術助力動物細胞圖譜繪制的高分文章解讀，希望能給老師后續(xù)的研究提供思路。

動物細胞圖譜分析繪制案例：黑腹果蠅

中文標題：果蠅細胞圖譜：成年果蠅的單核轉錄組圖譜

英文標題：Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly

期刊：Science[IF: 63.714] 2022.3.4

DOI：10.1126/science.abk2432

實驗設計

實驗材料：黑腹果蠅

實驗方法：解剖了來自雌性和雄性黑腹果蠅的12個組織（觸角、體壁、脂肪體、平衡棒、心臟、腸道、腿、馬氏管、絳色細胞、喙和下顎須、氣管、翅膀）以及3個性別特異性組織（雄性生殖腺、睪丸、卵巢）。對于遍布全身的組織使用特異性GAL4驅動核-GFP蛋白，再用流式細胞熒光分選技術標記和收集細胞核，進行單細胞核snRNA-seq

測序策略：單細胞核轉錄組10x Genomics、Smart-seq2

研究內容

黑腹果蠅在生物學研究方面有著豐富的歷史，以往研究探索了其不同組織中的表達模式，但缺乏細胞類型分辨率級別的數(shù)據(jù)庫。近年來單細胞技術的進步使得同時對數(shù)千個細胞進行轉錄組分析成為可能，促進了全組織細胞圖譜的創(chuàng)建。然而，現(xiàn)有scRNA-seq數(shù)據(jù)集來自不同實驗室，是基于不同遺傳背景，不同分離方法以及不同測序平臺產(chǎn)生的，阻礙了跨細胞和組織的基因表達的系統(tǒng)性分析。

該研究通過對果蠅多組織進行單細胞核轉錄組測序后，得到了果蠅細胞圖譜。之后對15個組織進行詳細的細胞注釋，在果蠅頭部，注釋到了81種主要的神經(jīng)細胞類型，在果蠅的軀體中注釋了最豐富的33種細胞類型。該圖譜還可用于進行相同細胞的跨組織分析，作者通過分析血細胞在整個組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)了血細胞中最常見的細胞類型——漿細胞，并未在成蟲血細胞中觀察到葉狀血細胞。通過對肌肉細胞在不同組織類型進行比較，發(fā)現(xiàn)它們主要在果蠅軀體、體壁和腿部有特定的富集，并發(fā)現(xiàn)內臟肌、骨骼肌、間接飛行肌的分離。

通過轉錄因子分析，找到了500個轉錄因子和細胞類型具有高特異性，繪制了每種細胞類型中特異轉錄因子的表達熱圖。此外，作者還使用SCENIC預測了基于共表達和motif富集的基因調控網(wǎng)絡。通過對廣泛細胞類型或組織的基因進行比較分析，發(fā)現(xiàn)了在各種細胞類型中的常見表達基因和特定表達基因。

通過對性別依賴的基因表達和性別特異性組織分析，發(fā)現(xiàn)體細胞中的主要性別決定基因doublesex（dsx）的表達在很大程度上不具有性別特異性，而許多其他基因的表達具有性別依賴。作者進一步對精母細胞和精細胞進行軌跡推斷，發(fā)現(xiàn)精母細胞期被轉錄的基因數(shù)量持續(xù)增加，許多強烈上調的基因在任何其他細胞類型中都沒有基本表達。然而，晚期精母細胞顯示了來自許多其他細胞類型的標記基因的表達。

動物細胞圖譜分析繪制案例：食蟹猴

中文標題：食蟹猴單細胞轉錄組和調控組參考圖譜

英文標題：A reference single-cell regulomic and transcriptomic map of cynomolgus monkeys

期刊：Nature comuiations?[IF: 17.694]?2022.07.13

DOI：10.1038/s41467-022-31770-x

實驗設計

實驗材料：成年食蟹猴

實驗方法：選取16個器官（心、肝、脾、肺、腎、胃、結腸、肌肉、氣管、主動脈、脂肪、膀胱、舌頭、乳腺、子宮和睪丸）

測序策略：10x Genomics單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）和單細胞染色質開放性測序（scATAC-seq）

研究內容

非人類靈長類動物（Non-human primates）在系統(tǒng)發(fā)育上與人類非常接近，在遺傳、器官發(fā)育、生理功能、病理反應和生化代謝等諸多方面表現(xiàn)出與人類相似的特征，是生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)的理想實驗動物模型。其中，最為典型的代表當屬食蟹猴。系統(tǒng)評估食蟹猴等非人靈長類動物模型與人類的細胞組成差異、器官異質性和基因表達時空特異性等在基礎研究中具有十分重要的價值。

該研究對成年食蟹猴的16個代表性器官進行單細胞轉錄組測序和單細胞染色質開放性測序，構建了食蟹猴多器官的單細胞多組學參考圖譜，將25萬個細胞進行 t-SNE降維聚類得到40余種不同的細胞亞群。

通過對該細胞圖譜進行分析，鑒定到了新的細胞類型。為了解析上皮細胞異質性，作者提取上皮細胞并進行亞群聚類分析。根據(jù)marker基因的獨特表達模式，分析鑒定出14個上皮細胞簇，包括基底細胞、分泌細胞、纖毛細胞和非纖毛細胞。纖毛上皮細胞在各種組織中都占很大比例，為了探索纖毛上皮細胞亞型的發(fā)育和功能動態(tài)，作者選用纖毛上皮細胞相對較多的器官，使用Monocle和RNA速度分析對纖毛上皮細胞進行軌跡分析，觀察到纖毛細胞從祖細胞狀態(tài)向成熟狀態(tài)分化的過程，沿著擬時間高表達的基因在與代謝過程、細胞對刺激的反應和防御反應相關的基因本體(GO)術語中順序富集。

使用CellPhoneDB細胞通訊分析，發(fā)現(xiàn)基質細胞、上皮細胞和髓系細胞之間存在強烈的細胞間相互作用。通常，細胞間相互作用的強度和模式是器官特異性的。為了重新繪制調節(jié)細胞-細胞相互作用的分子相互作用，作者在不同器官的特定細胞亞群中繪制了配體-受體對，揭示了猴子各種器官細胞間通信的潛在分子機制。

結合表達譜和染色質開放性數(shù)據(jù)，作者分析預測了控制不同細胞類型基因表達模式的關鍵調控子。發(fā)現(xiàn)SPIB、POU2F2、SPI1、CEBPD和IRF4是髓系細胞中的關鍵調控子；而FEV具有調節(jié)造血干細胞的潛能，該轉錄因子廣泛參與對免疫細胞和上皮細胞的基因表達調控。大多數(shù)順式調控元件(CREs或ATAC峰)來自啟動子、內含子或遠端基因間調控區(qū)。在scATAC-seq數(shù)據(jù)中預測了9種細胞類型，在RNA簇中發(fā)現(xiàn)了兩種罕見的細胞類型，單核細胞和循環(huán)B細胞，但在ATAC簇中沒有發(fā)現(xiàn)?？傊疚闹械膕cATAC-seq數(shù)據(jù)為無偏見地發(fā)現(xiàn)食蟹猴的細胞類型和調控DNA元件提供了豐富的資源。

最后，作者進行了跨物種比較分析，通過整合分析器官匹配的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)，探討了人、食蟹猴和小鼠三個物種之間的細胞組成和基因表達特異性。猴子和人類在同源基因表達方面表現(xiàn)出明顯高于其他比較的細胞類型相似性。其中，免疫細胞相較于非免疫細胞，人類和猴子之間的基因表達具有更高的相似性。間質細胞在人鼠和猴鼠比較中表現(xiàn)出最高的相似性。這些發(fā)現(xiàn)表明，猴子在免疫系統(tǒng)中與人類具有高度相似的轉錄程序，因此可能為研究對癌癥或新冠病毒COVID-19等疾病的免疫反應提供理想的模型。

 

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