近日，北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與食品營養(yǎng)研究所左進華研究員團隊聯(lián)合美國賓夕法尼亞州立大學(xué)馬紅教授團隊完成超高質(zhì)量苦瓜變種‘金鈴子’T2T基因組。主要研究成果“Telomere-to-telomere genome assembly of bitter melon (Momordica charantia L. var.?abbreviata Ser.) reveals fruit development, composition and ripening genetic characteristics”在線發(fā)表于園藝TOP期刊Horticulture Research。該研究揭示了‘金鈴子’基因組組成和進化關(guān)系以及果實生長發(fā)育的分子調(diào)控機制，進一步細(xì)化了苦瓜亞種材料差異表型的基因組變異特征，以及果實品質(zhì)的關(guān)鍵信息。本研究是該團隊在葫蘆科領(lǐng)域的完成的第3個高質(zhì)量基因組，為葫蘆科系統(tǒng)發(fā)育與應(yīng)用研究起到了重要的推動作用。百邁客張學(xué)雯、余瑩作為共同作者，參與了本項研究。
?研究背景
葫蘆科苦瓜的變種‘金鈴子’（Momordica charantia?L. var. abbreviata?Ser. (Mca)），又稱為癩葡萄，主要分布在南亞、東南亞和中國。其果實個體略小于苦瓜（M. charantia?L. (MC)），具有重要的食用、觀賞與保健等功能。在果實成熟過程中，果皮從綠色變?yōu)辄S色/橙色，果肉從苦味的白色變?yōu)楦侍鸬募t色。其因口味和營養(yǎng)成分而聞名，但高質(zhì)量基因組的缺乏不利于相關(guān)分子機制的研究，阻礙了進一步的應(yīng)用。
Telomere-to-telomere（T2T）基因組是指通過多種測序平臺、高深度測序，完成端粒與著絲粒組裝的gap-free或近gap-free高質(zhì)量基因組。T2T基因組的構(gòu)建將進一步助力物種基因組中復(fù)雜區(qū)域的解析，尤其是早期難以被破解的“黑色領(lǐng)域”，可為‘金鈴子’深度研究提供重要的基礎(chǔ)信息。
金鈴子成熟期果實剖面圖
材料方法
Denovo測序： survey 21.28 Gb（~74.31×）；HiFi 31 Gb（~103.96×）；Hi-C 51 Gb（~178 X）
RNA-seq：三個不同成熟期的果皮；每個材料3個生物學(xué)重復(fù)。
ATAC-seq：三個不同成熟期的果肉；每個材料3個生物學(xué)重復(fù)。
代謝組：三個成熟期的果肉和果皮; 每個材料3個生物學(xué)重復(fù)；HPLC-MS
研究結(jié)果
1、金鈴子T2T基因組組裝
調(diào)研圖結(jié)果顯示，金鈴子基因組大小286.40 Mb，雜合度0.12%，較低的雜合與重復(fù)使得更高質(zhì)量的基因組組裝成為可能。本研究基于高深度的HiFi reads組裝以及Hi-C輔助染色體掛載，最終完成296 Mb苦瓜金鈴子基因組的組裝（contigN50=25.3 Mb；掛載率99.87%），注釋出20,068個基因。組裝結(jié)果顯示金鈴子11條染色體中均檢測到著絲粒信號，且8條染色體上均無gap存在，其中6條染色體既gapfree同時也檢測到兩端的端粒信號（CCCTAAA）n。
通過二代數(shù)據(jù)回比、三代數(shù)據(jù)回比、CEGMA評估（98.69%）、BUSCO評估（98.02%）、Mercury評估（integrity= 99.6%；QV=45.2；error rate ~0.003%）等多項評估顯示，本次研究構(gòu)建了一個具有高完整性和準(zhǔn)確性的的端粒至端粒的超高質(zhì)量苦瓜金鈴子基因組。這種高質(zhì)量的無間隙基因組有助于探究該物種的基因奧秘。
圖1 金鈴子基因組組裝與核型結(jié)果
表1 基因組組裝結(jié)果
2、比較基因組學(xué)與變異比較分析
研究顯示，苦瓜在115.08-120.42 Mya時從其他近緣種中分化出來，0.53-52.49 Mya金鈴子與苦瓜發(fā)生分化。共線性分析顯示，在甜瓜、絲瓜、‘金鈴子’中檢測到了在馴化過程中對果實成熟和風(fēng)味形成起作用的幾個共線基因，主要參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、葫蘆素和類胡蘿卜素合成途徑。
‘金鈴子’的特有基因家族成員與RNA聚合酶、倍半萜和三萜生物合成、嘌呤代謝和光合作用-天線蛋白有關(guān)。金鈴子中擴張基因家族與光合作用、苯丙氨酸代謝和二萜生物合成有關(guān)，而收縮基因家族與亞油酸代謝和二甾生物合成相關(guān)。
圖2 葫蘆科物種比較基因組研究結(jié)果
隨后作者將‘金鈴子’與苦瓜進行比對，以分析亞種材料間關(guān)鍵的變異信息。研究結(jié)果顯示，兩個材料間存在211,329個SNPs和100,187個InDels，并檢測到374個SV，即39個TRANs、18個INV和317個DUP。這些SVs主要影響編碼萜類合成酶10（TPS10）、聚半乳糖醛酸酶（PG）、黃酮醇合成酶（FLS）等基因，這些基因與植物激素、果實質(zhì)地和萜烯代謝有關(guān)。PAV檢測中，發(fā)現(xiàn)僅在‘金鈴子’中存在的基因主要參與倍半萜和三萜生物合成、甘油脂代謝和甘油磷脂代謝，這些基因可能在‘金鈴子’進化中發(fā)揮重要作用，并最終影響其表型特征和功能特性。
3、金鈴子果實生長發(fā)育研究
染色質(zhì)的開放區(qū)包含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（TFBS），在轉(zhuǎn)錄因子（TFs）介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。因此，作者通過對‘金鈴子’三個時期的果實材料進行ATAC-seq分析，以確定在生長過程中差異的染色質(zhì)開放區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，未成熟果實與破色期果實中，6號染色體上存在差異染色質(zhì)開放區(qū)，主要是與類胡蘿卜素途徑和植物激素信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因；破色期與成熟期果實相比，3號染色體上存在差異染色質(zhì)開放區(qū)，主要的影響基因有乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子WRI1、乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子ERF118和生長素應(yīng)答因子1（ARF1）等。
圖 3
?為了更全面地了解‘金鈴子’果實的發(fā)育成熟過程，作者對‘金鈴子’果實三個不同生長發(fā)育期的轉(zhuǎn)錄組和代謝組進行了系統(tǒng)分析。在果實生長發(fā)育前期，共鑒定出515個差異基因和216個差異代謝物，在果實生長發(fā)育后期，鑒定出4593個差異基因和376個差異代謝物，這些差異基因和差異代謝物參與調(diào)控‘金鈴子’果實生長發(fā)育過程中葫蘆素、皂苷、植物激素、氨基酸、脂類、類胡蘿卜素等的生物合成和代謝過程。這些差異決定了‘金鈴子’果實的品質(zhì)、營養(yǎng)價值以及果皮顏色的變化，為苦瓜基因組研究提供了一個新的遺傳資源。
圖4
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