免疫調(diào)控應(yīng)用有哪些？研究機制及進展

近幾年國家自然科學(xué)基金資助項目中，免疫調(diào)控項目占比年年創(chuàng)新高，從2022年國自然公布的情況來看，免疫調(diào)控依舊是國自然的重點、熱點領(lǐng)域。機體用來防御感染和疾病的免疫系統(tǒng)在免疫調(diào)節(jié)過程中，通過免疫器官、免疫細(xì)胞細(xì)胞、免疫活性物質(zhì)以及其它系統(tǒng)之間組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制，來維持機體的穩(wěn)定，免疫系統(tǒng)的紊亂與調(diào)節(jié)機制也就成為了醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究中的熱門領(lǐng)域。

免疫系統(tǒng)分為固有免疫和適應(yīng)性免疫，固有免疫是機體在發(fā)育和進化過程中形成的天然免疫防御功能，也稱為非特異性免疫；與此相對應(yīng)的是適應(yīng)性免疫，指出生后通過與抗原物質(zhì)接觸所產(chǎn)生的一系列防御功能，包括B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答主要依賴于B細(xì)胞受體（B Cell Recptor, BCR）和T細(xì)胞受體（T Cell Recptor, TCR）識別多種多樣的抗原分子，發(fā)揮功能清除病原體或體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，BCR和TCR基因中產(chǎn)生巨大的序列變異，可以創(chuàng)造大量的具有不同免疫受體和抗原特異性的淋巴細(xì)胞。因此在單細(xì)胞水平分析免疫微環(huán)境細(xì)胞組成、表達模式、生物學(xué)功能及細(xì)胞間相互作用模式等特征，可以更深入了解免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制，而單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)就是在解析免疫微環(huán)境特征的同時，還能揭示T/B淋巴細(xì)胞抗原受體多樣性，為適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程的探索提供更清晰的視角。

研究進展

免疫學(xué)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個主要領(lǐng)域，是許多重要科學(xué)的研究熱點和醫(yī)學(xué)突破的前沿，免疫細(xì)胞參與人體多器官疾病的發(fā)展，對免疫信號傳導(dǎo)、免疫細(xì)胞遷移和免疫組庫的詳細(xì)了解有助于開發(fā)新的治療方法來對抗各種疾病，識別與這些疾病發(fā)生密切相關(guān)的免疫細(xì)胞，可以進一步發(fā)現(xiàn)這些疾病的分子機制。利用單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)，基于大量的單細(xì)胞基因表達和克隆型的多樣性數(shù)據(jù)，可以提供細(xì)胞表達特征聚類、亞群表達特征的分析、標(biāo)志物篩選等方面的分析，揭示免疫組庫克隆性、多樣性、抗原特異性和細(xì)胞微環(huán)境[1]，目前已廣泛應(yīng)用在基礎(chǔ)免疫學(xué)研究、自身免疫性疾病、移植與免疫重建、腫瘤免疫與治療、傳染病及疫苗研發(fā)等研究領(lǐng)域。

1)利用單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)，追蹤適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的發(fā)育與建立，如探究胸腺器官發(fā)育圖譜、解析不同發(fā)育時期V(D)J重組特征；探索健康和疾病狀態(tài)下免疫系統(tǒng)的基本生物學(xué)，重新定義免疫細(xì)胞類型和分子特征，解析疾病進展中免疫失調(diào)特征；

2)利用單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)，理解腫瘤與免疫的相互作用，尋找惡性腫瘤免疫治療的潛在靶點；揭示移植體抗宿主病背后的生物學(xué)機制，為免疫調(diào)節(jié)治療提供潛在方向；破譯錯誤導(dǎo)向免疫應(yīng)答的機制，解析免疫耐受機制與免疫應(yīng)答動態(tài)調(diào)節(jié)之間的復(fù)雜相互作用；

3）利用單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)，表征腫瘤患者對免疫檢查點阻斷的應(yīng)答，篩選獲益人群；改造T細(xì)胞開發(fā)新的癌癥免疫治療策略（CAR-T、TCR-T細(xì)胞療法）；了解疫苗接種后的抗體應(yīng)答，助力疫苗開發(fā)…..

免疫調(diào)控應(yīng)用案例

利用單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)，探索健康和疾病狀態(tài)下免疫系統(tǒng)的基本生物學(xué),鑒定人體內(nèi)的免疫細(xì)胞身份、功能和組織，并應(yīng)用到免疫學(xué)的各個領(lǐng)域，包括分析新興病原體、開發(fā)疫苗、開發(fā)免疫腫瘤學(xué)療法、認(rèn)識自身免疫疾病及實施安全的器官移植等。

01、繪制組織免疫圖譜

免疫調(diào)控應(yīng)用案例1、單細(xì)胞免疫組庫分析揭示人組織特異性免疫特征[2]

標(biāo)題：Cross-tissue immune cell analysis reveals tissue-specific features in humans

期刊名稱：Science

影響因子：63.714

發(fā)表時間：2022年5月

樣本設(shè)計：2個成人捐獻者的16份組織樣本，分別進行scRNA、scTCR、scBCR，實驗中采集的組織樣本包括初級淋巴器官（骨髓）和次級淋巴器官（脾、肺引流和腸系膜淋巴結(jié)）、粘膜組織（腸和肺）以及血液和肝臟等非淋巴組織，還包括胸腺、骨骼肌和網(wǎng)膜。

研究內(nèi)容：目前對于人體組織中免疫細(xì)胞的分型仍知之甚少，無法快速精準(zhǔn)地對免疫細(xì)胞進行分型。本研究通過單細(xì)胞免疫組庫測序對16份組織類型樣本進行分析，得到了357,211個單細(xì)胞數(shù)據(jù)，其中329,762個細(xì)胞都是免疫細(xì)胞，確定了43個細(xì)胞特異性的細(xì)胞亞群，構(gòu)建了人類跨組織的免疫細(xì)胞圖譜，揭示了已知免疫細(xì)胞類型在不同組織微環(huán)境中的分布情況，并解析了人類免疫系統(tǒng)的組織特異性以及豐富的T細(xì)胞和B細(xì)胞克隆型，同時開發(fā)了CellTypist細(xì)胞類型自動注釋平臺。

免疫調(diào)控應(yīng)用案例2、人類胸腺發(fā)育細(xì)胞圖譜揭示了T細(xì)胞組庫的形成[3]

標(biāo)題：A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation

期刊名稱：Science

影響因子：41.845

發(fā)表時間：2020年2月

樣本設(shè)計：共采集了15個胎兒胸腺（從7-17孕周）和9個出生后至成人期的胸腺樣本，4、8和24 w孕周小鼠胸腺樣本，并根據(jù)CD45、CD3和EpCAM表達對分離的流式分選富集免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞、T細(xì)胞、上皮細(xì)胞，進行scRNA-seq + scTCR-seq。

研究內(nèi)容：胸腺是T細(xì)胞發(fā)育和TCR形成的重要器官，塑造了機體的適應(yīng)性免疫，T細(xì)胞的胸腺內(nèi)發(fā)育有空間協(xié)調(diào)性，受胸腺微環(huán)境多種細(xì)胞類型的精細(xì)調(diào)節(jié)，但目前尚缺少一份完整的人類胸腺圖譜幫助理解人體免疫系統(tǒng)。本研究繪制了胸腺單細(xì)胞時空圖譜，描繪了胸腺來源T細(xì)胞的多樣性以及構(gòu)成胸腺微環(huán)境的細(xì)胞空間定位；在單細(xì)胞分辨率下重建T細(xì)胞發(fā)育軌跡，揭示了人 TCR 免疫組庫形成和選擇的偏倚特征，提示了人體如何應(yīng)對不同的抗原挑戰(zhàn)；最后，提供了人類和小鼠胸腺細(xì)胞圖譜之間的系統(tǒng)比較。

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02、解析疾病機制

免疫調(diào)控應(yīng)用案例3、單細(xì)胞免疫組庫揭示了川崎病發(fā)病和治療過程中外周免疫細(xì)胞動態(tài)變化[4]

標(biāo)題：Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease Patients

期刊名稱：Nature Communications

影響因子：17.694

發(fā)表時間：2021年9月

樣本設(shè)計：7名急性KD患者接受靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）治療前、后，3例年齡匹配的健康對照，取新鮮外周血PBMC樣本，進行scRNA+scTCR+scBCR測序。

研究內(nèi)容：川崎?。↘D）是一種急性全身性發(fā)熱性疾病和兒童期血管炎，可導(dǎo)致冠狀動脈病變，已成為許多發(fā)達國家兒童獲得性心臟病的常見原因。盡管已經(jīng)報道了免疫細(xì)胞的功能和表型變化，但對急性KD全局免疫反應(yīng)的理解尚不清楚。本研究通過對IVIG治療前后的KD患者PBMC樣本進行單細(xì)胞免疫組庫測序，發(fā)現(xiàn)了CD8+T細(xì)胞在治療后的特異性克隆擴增，提示是常規(guī)抗原而非超抗原可能是KD發(fā)病機制的原因，CD8+T相關(guān)細(xì)胞的比例是川崎病的重要風(fēng)險因素；研究繪制了川崎病外周血單細(xì)胞免疫圖譜，揭示了川崎病治療前后及對照中PBMC各類型免疫細(xì)胞比例、基因表達、免疫反應(yīng)、生物學(xué)功能以及細(xì)胞表面受體的變化。

免疫調(diào)控應(yīng)用案例4、單細(xì)胞免疫組庫揭示鼻咽癌微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞特征[5]

標(biāo)題：Comprehensive single-cell sequencing reveals the stromal dynamics and tumor-specific characteristics in the microenvironment of nasopharyngeal carcinoma

期刊名稱：Nature Communications

影響因子：17.694

發(fā)表時間：2021年9月

樣本設(shè)計：11例鼻咽癌患者的腫瘤樣本和3例非惡性鼻咽淋巴增生的樣本，進行scRNA+scTCR+scBCR測序。

研究內(nèi)容：鼻咽癌的病理學(xué)特征表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)部和附近經(jīng)常被成分復(fù)雜的免疫細(xì)胞所浸潤，這種微環(huán)境特征在理論上表明了免疫治療在鼻咽癌中具有極高的潛力。然而在I期和II期臨床試驗中，鼻咽癌患者對免疫療法的反應(yīng)率僅有 20%-30%，表明鼻咽癌微環(huán)境中細(xì)胞異質(zhì)性和動態(tài)功能需要進一步精準(zhǔn)解析，從而優(yōu)化針對鼻咽癌的精準(zhǔn)治療。本研究利用單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)系統(tǒng)地對比了鼻咽癌腫瘤微環(huán)境和非惡性鼻咽微環(huán)境的構(gòu)成和功能狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)初始B細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞和效應(yīng)B細(xì)胞和鼻咽癌患者的預(yù)后呈顯著正相關(guān)，雙陰性B細(xì)胞則和鼻咽癌患者的預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)，成為預(yù)測鼻咽癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物；耗竭T細(xì)胞高度表達 CXCL13，可能是招募 CXCR5⁺?B細(xì)胞并促進三級淋巴結(jié)構(gòu)形成的重要分子機制，可能是影響B(tài)細(xì)胞在鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中浸潤程度的因素之一；該研究發(fā)現(xiàn)了與鼻咽癌患者預(yù)后相關(guān)的特征基因和細(xì)胞亞群，從而為研究鼻咽癌微環(huán)境中的分子機制和優(yōu)化鼻咽癌精準(zhǔn)治療提供了分子生物學(xué)上的依據(jù)。

免疫調(diào)控應(yīng)用案例5、單細(xì)胞免疫組庫揭示多發(fā)性硬化癥新機制[6]

標(biāo)題：Bone marrow hematopoiesis drives multiple sclerosis progression

期刊名稱：Cell

影響因子：66.850

發(fā)表時間：2022年6月

樣本設(shè)計：MS患者及健康對照各7例，取骨髓樣本，進行scRNA-seq+scTCR-seq。

研究內(nèi)容：多發(fā)性硬化癥（MS）是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，也是一種伴隨終生的神經(jīng)退行性疾病，T細(xì)胞失去自身免疫耐受是MS癥狀的核心機制，骨髓作為中樞免疫器官和造血器官，對維持外周和中樞的免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用，但其對MS疾病進展的影響還不清楚。本研究利用單細(xì)胞免疫組庫測序、流式細(xì)胞術(shù)及譜系追蹤分析了MS患者在疾病活動期骨髓造血系統(tǒng)的特征，與健康對照組相比，MS患者的造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞及髓系細(xì)胞數(shù)量顯著增加，骨髓T細(xì)胞克隆數(shù)量和多樣性明顯增加；MS小鼠模型骨髓微環(huán)境的趨化因子CXCL12驅(qū)動自身反應(yīng)性T細(xì)胞大量進入骨髓，在到達骨髓后高度表達趨化因子CCL5，從而引起髓系增生，為治療MS提供了新思路–通過再平衡骨髓造血系統(tǒng)，回歸免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，從而減輕神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷。

03、臨床應(yīng)用

免疫調(diào)控應(yīng)用案例6、單細(xì)胞免疫組庫揭示腎透明細(xì)胞癌組織駐留T細(xì)胞與免疫治療療效[7]

標(biāo)題：Single-cell sequencing links multiregional immune landscapes and tissue-resident T cells in ccRCC to tumor topology and therapy efficacy

期刊名稱：Cancer Cell

影響因子：38.585

發(fā)表時間：2021年5月

樣本設(shè)計：6例接受和未接受ICB治療的腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）患者癌組織、淋巴結(jié)、癌旁組織和血液PBMC，共29個樣本，進行scRNA-seq?+ scTCR-seq。研究內(nèi)容：ccRCC具有高度免疫浸潤性，免疫檢查點阻斷（ICB）治療和聯(lián)合方案顯著提高ccRCC患者的生存率，但免疫異質(zhì)性對于鑒定更有效的ccRCC治療靶標(biāo)及預(yù)測響應(yīng)水平的生物標(biāo)志物產(chǎn)生了干擾。本研究針對免疫治療前后ccRCC組織和PBMC樣本分別進行單細(xì)胞免疫組庫測序分析，構(gòu)建了167,283個細(xì)胞基因表達圖譜和43,828個細(xì)胞的TCR克隆型圖譜，共鑒定到28個細(xì)胞亞群；構(gòu)建了167,283個細(xì)胞基因表達圖譜和43,828個細(xì)胞的TCR克隆型圖譜，共鑒定到28個細(xì)胞亞群，繪制ccRCC的多區(qū)域免疫異質(zhì)性圖譜；TCR克隆序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)ICB耐藥組高擴增克隆型間克隆序列存在高度相似性；TCR分化軌跡分析，發(fā)現(xiàn)在ICB響應(yīng)組CD8+組織駐留T細(xì)胞與NK樣細(xì)胞存在相互轉(zhuǎn)化軌跡；結(jié)合TCGA多隊列免疫治療數(shù)據(jù)分析，驗證了CD8+組織駐留T細(xì)胞的預(yù)后價值，能夠一定程度上預(yù)測免疫治療的療效。

免疫調(diào)控應(yīng)用案例7、單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)潛在的SARS-CoV-2中和抗體[8]

標(biāo)題：Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’?B Cells

期刊名稱：Cell

影響因子：36.216

發(fā)表時間：2020年5月

樣本設(shè)計：從12個COVID-19康復(fù)患者的外周血單核細(xì)胞PBMC中分離B細(xì)胞，對B細(xì)胞和CD27⁺記憶B細(xì)胞進行scRNA-seq + scBCR-seq，獲得IgG1亞型抗體，并進行抗體體外檢測和篩選。

研究內(nèi)容：針對新冠病毒人源單克隆抗體的分離鑒定的方法，如單個記憶 B 細(xì)胞的克隆擴增，通常用于從異質(zhì)B細(xì)胞群體中獲得免疫球蛋白輕重鏈RNA序列，以產(chǎn)生單克隆抗體，但由于耗時的孵化和篩選步驟，使該技術(shù)至少需要幾個月才能完成成功的篩選。本研究利用單細(xì)胞免疫組庫技術(shù)對60名新冠病毒感染恢復(fù)期患者富含抗原的B細(xì)胞進行分析，從8,558種抗原結(jié)合 IgG1+克隆型中鑒定出了14種有效的中和抗體，其中強效的BD-368-2在SARS-CoV-2感染的 hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠中也顯示出強大的治療和預(yù)防功效；研究證明了通過B細(xì)胞的單細(xì)胞高通量測序技術(shù)可以大大縮短抗體的篩選周期，有效發(fā)現(xiàn)人源中和單克隆抗體，為新冠病毒以及未來大流行病的抗體疫苗研發(fā)提供了非常重要的科學(xué)和實用價值。

免疫調(diào)控應(yīng)用案例8、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合TCR-seq解析了腫瘤抗原特異性T細(xì)胞及生物標(biāo)志物鑒定[9]

標(biāo)題：Defined tumor antigen-specific T cells potentiate personalized TCR-T cell therapy and prediction of?immunotherapy response

期刊名稱：Cell Research

影響因子：46.297

發(fā)表時間：2022年6月

樣本設(shè)計：通過scRNA-seq、scTCR-seq和體外新抗原刺激，對腫瘤及其鄰近組織中的T細(xì)胞進行了全面解析。

研究內(nèi)容：針對腫瘤特異性抗原（TSA）的個性化免疫療法可以在不損害正常組織的情況下產(chǎn)生有效和安全的抗腫瘤免疫反應(yīng)，盡管新抗原疫苗已在臨床試驗中顯示出治療效果，但從腫瘤突變中預(yù)測新抗原仍然具有挑戰(zhàn)性，宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)選擇并激活識別腫瘤抗原的T細(xì)胞；因此用來自患者體內(nèi)這些天然存在的腫瘤抗原特異性T（Tas）細(xì)胞的T細(xì)胞受體改造的T細(xì)胞將靶向患者腫瘤中的TSA。本研究揭示了Tas 細(xì)胞的特點是腫瘤富集、腫瘤特異性克隆擴增和新抗原特異性；評估了腫瘤中Tas細(xì)胞標(biāo)記物CXCL13的表達水平可能比來自免疫周期早期步驟的標(biāo)志物（如TMB）更jing q 地預(yù)測對ICB 的反應(yīng)；并將CD200和ENTPD1分別鑒定為CD4+和CD8+Tas細(xì)胞的表面標(biāo)志物。

百邁客項目經(jīng)驗

免疫器官可分為中樞免疫器官和外周免疫器官，免疫器官分為中樞免疫器官和外周免疫器官，前者包括胸腺和骨髓，是免疫細(xì)胞形成和分化成熟的場所；后者包括淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體、闌尾、腸集合淋巴結(jié)、呼吸道和消化道黏膜下層等淋巴組織，是T/B淋巴細(xì)胞定居、增殖的場所及發(fā)生免疫應(yīng)答的主要部位。兩者則主要是通過血液循環(huán)及淋巴循環(huán)相互聯(lián)系，從目前發(fā)表的10x單細(xì)胞免疫組庫文章樣本類型數(shù)目統(tǒng)計來看，外周血和相關(guān)免疫器官的免疫多樣性特征研究是主要聚焦方向。

百邁客自2019年推出單細(xì)胞免疫組庫測序服務(wù)后積累了大量的項目經(jīng)驗，目前累計已完成1000+個樣本的分選富集，包含25+種組織類型，涉及疾病類型超40+種，包含結(jié)直腸癌、白血病、皮膚病、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、宮頸癌、鼻咽癌、黑色素瘤等。

與圖2展示的類似，百邁客實測項目中血液樣本數(shù)量很多，占比超60%；血液樣本相較于組織樣本，無需進行細(xì)胞解離，能夠避免細(xì)胞解離引起的細(xì)胞活性受損、細(xì)胞類型丟失等問題；尤其是臨床樣本，往往涉及到組織樣本獲取難度大的問題，患者治療后腫瘤組織取樣更是很多老師的困擾，因此取配對的血液樣本就成了一個合適的替代方案，在臨床監(jiān)測、標(biāo)志物診斷方面更是具有巨大的優(yōu)勢。

Tips：對于血液樣本，送樣量2-3mL即可，推薦選擇上門服務(wù)；如果需要寄送，可用EDTA紫色抗凝管保存，24h內(nèi)寄送到百邁客實驗室分離PBMC上機；或者分選完P(guān)BMC后加細(xì)胞凍存液梯度凍存，干冰寄送。

小結(jié)

通過單細(xì)胞免疫組庫測序，構(gòu)建組織/疾病高分辨率細(xì)胞異質(zhì)性圖譜，全面解析基因表達及免疫組庫多樣性，挖掘與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞亞群和信號通路變化、克隆型擴增，為鑒定預(yù)后診斷分子標(biāo)記物、優(yōu)化升級癌癥免疫治療療法、開發(fā)抗體/疫苗等臨床應(yīng)用提供強有力的基礎(chǔ)。

百邁客單細(xì)胞空間多組學(xué)平臺

百邁客同時具有百創(chuàng)DG1000和10x Genomics單細(xì)胞測序服務(wù)平臺、百創(chuàng)S1000和10x Genomics空間測序服務(wù)平臺，百創(chuàng)S1000空間測序技術(shù)更是“亞細(xì)胞級分辨率”和“微孔”結(jié)合的原位捕獲空間測序技術(shù)，其獨立設(shè)計的Spatial Barcode還可以高度適配Oxford Nanopore Technologies（ONT）平臺，助力國產(chǎn)化空間測序技術(shù)進入新的時代。

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