空間轉(zhuǎn)錄組測序技術識別蘭花早期發(fā)育的多種細胞類型并揭示其發(fā)育過程。

近日，Nucleic acids research（IF=19.160）在線發(fā)表了由復旦大學戚繼研究員團隊和江西農(nóng)業(yè)大學國春策教授團隊合作完成的研究論文“A spatiotemporal atlas of organogenesis in the development of orchid flowers”。本研究應用10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術對蘭科植物蝴蝶蘭（Phalaenopsis?Big Chili）的花器官的發(fā)育過程進行了研究。通過分析數(shù)千個與花發(fā)育相關基因的空間表達分布，高分辨率地識別了蘭花早期發(fā)育的多種細胞類型。百邁客有幸參與此項研究工作，為該研究提供了空間轉(zhuǎn)錄組測序服務。接下來，我們一起來看一下這篇文章講了一個怎樣的精彩故事。

研究背景

花器官的發(fā)育是被子植物中特有的一個神秘過程，涉及到細胞在特定位點的生長、分裂和分化以及細胞與細胞之間的相互作用等一系列細胞活動。典型的高等植物花器官一般可以分為四輪結(jié)構(gòu),從外向內(nèi)依次是萼片、花瓣、雄蕊和心皮。而控制花的四輪結(jié)構(gòu)發(fā)育的就是典型的“ABC”模型，MADS-box基因在其中起著非常重要的作用。

蘭科是被子植物中較大的科之一，有763屬，28,000多個種，被認為是研究花器官發(fā)育和進化的模式科。然而，對蘭花花發(fā)育復雜過程的全面認識還遠遠不夠，特別是缺乏對其器官發(fā)生關鍵調(diào)控網(wǎng)絡的時空研究。

研究思路

研究結(jié)果

1、蘭花花器官早期發(fā)育的空間轉(zhuǎn)錄組測序和細胞類型識別

為了提供花器官發(fā)生的時空細胞圖譜，以便全面理解器官發(fā)生的復雜過程，本研究在10×?Visium平臺上對蝴蝶蘭(P. Big Chili)三個總狀花序組織樣本的矢狀面進行了空間轉(zhuǎn)錄組測序，從時期上覆蓋了花序分生組織存在到接近成熟的花器官的大部分早期發(fā)育階段（圖1A）。研究團隊利用自主開發(fā)的STEEL算法，將空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)清晰地分為40個clusters（圖1B、C）。其中，花被片、唇瓣和花柱組織中的beads聚類性較好，且與相應的組織形態(tài)學檢測的觀察結(jié)果高度一致。 總之，三張切片的空間轉(zhuǎn)錄組共檢測到14,328個基因的表達，其中有3,817個基因被鑒定為特異性或優(yōu)先在一個或多個組織中表達，為后續(xù)詳細分析從分生組織細胞到分化后細胞的細胞類型變化提供了分子圖譜。

圖1?基于空間轉(zhuǎn)錄組學的蘭花早期發(fā)育階段器官發(fā)生的重建

2.早期花原基存在分生組織細胞，隨后分化為營養(yǎng)型細胞和生殖細胞

為了研究從分生組織細胞到營養(yǎng)型細胞(花被、唇瓣)和生殖細胞(花柱)的分化，研究團隊用Monocle繪制了細胞狀態(tài)的軌跡。如圖2B所示，三簇分生組織細胞形成了一條連續(xù)的路徑，代表其發(fā)育過程，與其在組織學切片上的位置高度一致。該路徑分為兩條子路徑：一條是由花被片中的營養(yǎng)型細胞組成，另一條由花柱中的花藥原基生殖細胞組成。細胞類型變化的軌跡作為動態(tài)發(fā)育過程的靜態(tài)投影，也可以理解為分生組織細胞的擬時序分化。如圖2C所示，此時營養(yǎng)型細胞出現(xiàn)較早，并分散在子路徑的遠端。共鑒定出4,685個空間差異基因與發(fā)育擬時間相關，對這些基因繪制分支軌跡基因表達熱圖，發(fā)現(xiàn)它們隨著發(fā)育路徑的分離表現(xiàn)出不同的表達模式（圖2D）。MapMan功能富集圖顯示它們主要富集在細胞壁代謝、激素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA合成等功能上（圖2E）。通過基因的擬時分布圖發(fā)現(xiàn)許多其他基因可能在分生組織、營養(yǎng)組織和生殖組織的細胞分化過程中發(fā)揮作用(圖2F)。

圖2?分生組織細胞向營養(yǎng)型細胞和生殖細胞的分化

3.MADS-box基因的空間表達分布說明了決定蘭花花部器官的ABC code

為了發(fā)現(xiàn)蘭花中特異的ABC code，本研究對7種被子植物的MADS-box基因進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。在蝴蝶蘭中的21個ABCDEG類MADS-box基因中，有15個基因在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集上檢測到表達信號，且在不同組織部位呈現(xiàn)出優(yōu)先或特異的表達模式（圖3）。其中，AP3-like和PI-like基因(B類基因)均在花被片、唇瓣和花柱的原基中表達。特別是PAXXG070630在花柱頂端組織周圍表現(xiàn)出梯度表達信號，其中單個spot點表達量高，其周圍細胞的表達信號隨著離中心spot點的距離增大而減弱，表明花藥在發(fā)育的這一階段是從單個spot點開始的。AG-like（C類基因）的空間表達譜上也存在類似的情況，為花藥的器官發(fā)生提供了進一步的證據(jù)。而AP1-like基因（A類基因）優(yōu)先表達于分生組織中或廣泛表達于各器官中，AGL6-like（G類基因）則在唇瓣和花被片中特異表達。

4.持續(xù)激活的分生組織細胞群參與花被片的形成

通過對被片細胞進行發(fā)育軌跡分析，發(fā)現(xiàn)5號花苞被片細胞處于發(fā)育軌跡*遠端，基因表達呈現(xiàn)出高度一致性。而6號花苞被片細胞由4個亞群組成,顯示出細胞之間的高度異質(zhì)性。如圖4A所示，發(fā)育軌跡分析顯示，發(fā)育起始于基部分生組織細胞（cluster22、cluster27），然后路徑分散為在近期分化(cluster1)和早期分化(cluster2)的被片細胞。擬時序分析表明細胞狀態(tài)從分生組織到近期分化細胞再到早期分化細胞的持續(xù)變化(圖4B、C)。通過對6號花苞分生組織細胞群和分化早期、近期的被片細胞群中檢測到的987個基因，繪制分支軌跡基因表達熱圖，發(fā)現(xiàn)它們的表達水平與組織部位呈現(xiàn)高度相關性（圖4D）。分生組織、被片組織優(yōu)先表達的基因顯著富集在蛋白質(zhì)合成、光合作用和細胞壁合成等相關途徑上（圖4E）。

圖4?切片1中6號花苞的分生組織細胞向花被片細胞分化的分析

5.花藥發(fā)育的起始和隨后多種細胞類型的分化

與花被、唇瓣這類營養(yǎng)組織不同，花藥的發(fā)育起始時間更晚，過程也更為復雜?；ㄋ幤鹗加诨ㄖ敹说幕ㄋ幵?，如圖2A所示，spot點中B-和C-功能基因表達呈現(xiàn)高表達。與此同時，許多下游基因被激活，用于進一步的形態(tài)建成過程。例如，在6號花苞的花藥中心出現(xiàn)花粉塊，之后在7號和8號花苞中可以觀察到它的形狀變化過程（圖5A）。為了進一步探究花藥發(fā)育過程中基因表達的動態(tài)變化，收集了花藥原基或花粉上優(yōu)先表達的1,683個基因進行比較，發(fā)現(xiàn)不同花苞之間存在不同的表達模式。正如如圖5B所示，在5號花苞和8號花苞中分別有123和141個基因高表達。而其中大部分基因呈現(xiàn)從5號花苞到8號花苞整體減少的表達模式。展示了與蘭花生殖相關營養(yǎng)型細胞中特異表達或優(yōu)先表達的一系列關鍵基因，顯示了花藥發(fā)育過程中表達譜的動態(tài)變化。通過對三個樣本的120個clusters進行PCA分析，表明花藥的早期營養(yǎng)組織，雖然存在相似的基因表達模式，沒有表現(xiàn)出特異表達的基因，但在發(fā)育后期迅速經(jīng)歷了分化和形態(tài)建成過程（圖5C）。

圖5?花藥多發(fā)育階段的身份決定與形態(tài)建成

總? 結(jié)

本研究利用10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)分析了蝴蝶蘭花器官早期發(fā)育過程中基因表達的動態(tài)變化。通過對時空表達分布的比較，確定了在特定組織/階段優(yōu)先表達的數(shù)千個基因，包括MADS-box基因和許多其他潛在下游基因，形成了花器官初始化、身份決定和形態(tài)建成的模型。對蘭花開花發(fā)育過程進行了系統(tǒng)的研究，為進一步研究蘭花開花過程中復雜而重要的基因調(diào)控網(wǎng)絡提供了寶貴的資源。

百邁客空間轉(zhuǎn)錄組測序項目經(jīng)驗

百邁客空間轉(zhuǎn)錄組已在近百種物種上積累大量經(jīng)驗，建立了成熟的植物組織透化體系，主要包括莖、芽、花、根、種子等組織類型，部分項目經(jīng)驗詳情展示如下：

除了10x空間轉(zhuǎn)錄組項目經(jīng)驗和植物切片結(jié)果外，百邁客還有百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組的實測高清結(jié)果圖片供欣賞百創(chuàng)S1000的優(yōu)勢有：

• 亞細胞級分辨率
• 多級分辨率動態(tài)分析
• 1-8樣本，靈活上樣
• 兼容HE/甲苯胺藍染色，保留組織原始形態(tài)

如果對動植物空間轉(zhuǎn)錄組感興趣的老師，想要開展相關研究，歡迎點擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費為您設計文章思路方案。

參考文獻

Liu C, Leng J, Li Y, Ge T, Li J, Chen Y, Guo C, Qi J. A spatiotemporal atlas of organogenesis in the development of orchid flowers. Nucleic Acids Res. 2022 Sep 12:gkac773.