Natl Sci Rev：柑橘無(wú)融合生殖演化研究

2022年6月，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄧秀新院士團(tuán)隊(duì)在National Science Review上發(fā)表了題為“Structural variation and parallel evolution of apomixis in citrus during domestication and diversification”的研究論文，首次揭示了柑橘中不同屬間無(wú)融合生殖性狀存在平行進(jìn)化，回答了現(xiàn)代栽培柑橘?gòu)V泛存在無(wú)融合生殖的遺傳機(jī)制，對(duì)柑橘育種研究具有重要啟示。百邁客有幸參與本項(xiàng)研究，完成其中PacBio、Hi-C測(cè)序等工作。

研究背景

我國(guó)是柑橘的起源地之一，栽培品種類型繁多，柑、橘、橙、柚、葡萄柚、檸檬、金柑、雜柑等都有規(guī)?；脑耘?。柑橘?gòu)V泛存在無(wú)融合生殖的特性，導(dǎo)致后代基因型和母本保持一致，阻礙了柑橘的雜交育種進(jìn)程。因此，研究柑橘無(wú)融合生殖對(duì)于加速柑橘遺傳改良具有重要意義。此外，無(wú)融合生殖還被運(yùn)用于作物的雜種優(yōu)勢(shì)固定，具有重要應(yīng)用前景，對(duì)我國(guó)種業(yè)發(fā)展具有重要意義。柑橘是研究孢子體無(wú)融合生殖的模式材料，解析柑橘無(wú)融合生殖的遺傳機(jī)制，能夠?yàn)樽魑镫s種優(yōu)勢(shì)固定提供新的思路。

柑橘中的金柑屬在我國(guó)具有悠久的栽培歷史，山金柑 (Hongkong kumquat,?Fortunella hindsii) 是金柑屬的一種常綠野生果樹，具有無(wú)融合生殖和有性生殖兩種類型，是研究無(wú)融合生殖的良好材料。

主要研究結(jié)果

柑橘基因組組裝與結(jié)構(gòu)變異

為了解析柑橘珠心胚的進(jìn)化、遺傳和分子機(jī)制，作者對(duì)山金柑自交系Sy3-45進(jìn)行了基因組組裝。最終完成了323.72 Mb（contigN50=9.77?Mb）的高質(zhì)量基因組（圖1a），其連續(xù)性比之前的版本提高了4.4倍。BUSCO評(píng)估（97%）、共線性評(píng)估，均顯示本次構(gòu)建了高質(zhì)量的柑橘基因組。通過(guò)對(duì)不同起源、不同生殖模式柑橘的半合子基因數(shù)量進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)半合子基因數(shù)量與生殖模式有關(guān)，克隆和無(wú)融合生殖作物的半合子基因數(shù)量最高，而自交作物的半合子基因數(shù)量較低。

柑橘無(wú)融合生殖表型的多起源

收集了234份柑橘亞族的材料全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)（其中46份是該研究新測(cè)的山金柑種質(zhì)），這些數(shù)據(jù)中包括介于雜交起源的混合類群（即葡萄柚、甜橙、檸檬和酸橙）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，生殖模式在多種情況下從完全有性生殖向無(wú)融合生殖和再回到有性生殖（圖2）。無(wú)融合生殖表型在柑橘中廣泛分布，研究表明無(wú)融合生殖可能在該類群中有多個(gè)起源。對(duì)群體結(jié)構(gòu)分析區(qū)分的12個(gè)類群進(jìn)行全基因組的基因深入分析，發(fā)現(xiàn)基因滲入在全基因組廣泛存在。但聚焦到無(wú)融合生殖區(qū)段后發(fā)現(xiàn)，漸滲并不能解釋柑橘屬和金柑屬無(wú)融合生殖的發(fā)生。

無(wú)融合生殖和有性生殖群體的結(jié)構(gòu)和有害負(fù)擔(dān)

柑橘通過(guò)珠心進(jìn)行無(wú)融合生殖，保留了母體基因型，這可能導(dǎo)致基因組中有害突變和結(jié)構(gòu)變異（SVs）的積累。從234份材料中共鑒定出139,241個(gè)可靠的SVs，其中64.2%為缺失，16.6%為重復(fù)，15.5%為易位。山金柑的SV數(shù)量最高，可能與有效種群大小減少有關(guān)（圖3a）。具有無(wú)融合生殖的雜交群體的雜合有害變異約為有性生殖群體的1.45倍。隨后提出了雜種無(wú)融合生殖將SVs隱藏在雜合子狀態(tài)的假說(shuō)，這可能主要是隱性選擇造成的危害。因此，有性生殖的雜種可能會(huì)迅速以隱性純合的方式暴露有害變異。這個(gè)假說(shuō)解釋了為什么無(wú)融合生殖和有性生殖的天然雜交樣本中觀察到的自然雜種通常是無(wú)融合生殖的。有害突變的模式與SVs的模式一致，即與有性生殖群體相比，無(wú)融合生殖群體的隱性有害負(fù)擔(dān)較低（7.39%），雜合子SVs較多（約2.62倍）。在隱性模型下，從無(wú)融合生殖到有性生殖的生殖模式轉(zhuǎn)變導(dǎo)致種群適應(yīng)度在轉(zhuǎn)變后立即下降13.48±0.87%，但隨后恢復(fù)（圖3i）。相比之下，保持無(wú)融合生殖的種群保持種群適合度。

同一位點(diǎn)有助于金柑屬和柑橘屬的無(wú)融合生殖

山金柑具有無(wú)融合生殖和有性生殖兩種類型，為了定位山金柑無(wú)融合生殖的潛在位點(diǎn)，作者利用無(wú)融合生殖的山金柑系“DB”與兩個(gè)有性生殖的山金柑“PN”和“PN03”作為母本雜交構(gòu)建了一個(gè)分離群體（圖4a）。通過(guò)ΔSNP指數(shù)及KASP標(biāo)記等方式進(jìn)一步將相關(guān)位點(diǎn)縮小到chr4上313 Kb區(qū)域?；?13 Kb區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)及全基因組fb統(tǒng)計(jì)表明，至少有一些山金柑的無(wú)融合生殖是通過(guò)基因滲入產(chǎn)生的。進(jìn)行序列比對(duì)以進(jìn)一步確定與山金柑（313 Kb）、柑橘（380 Kb）和柚子（80 Kb）基因組共享的無(wú)融合生殖基因組區(qū)域中珠心胚發(fā)生和發(fā)育相關(guān)的主要原因（圖5a）。這三個(gè)區(qū)域之間的最小重疊包含FhRWP基因，這是一種RWP-RK域轉(zhuǎn)錄因子，與據(jù)報(bào)道與有助于柑橘無(wú)融合生殖的CitRWP基因同源。

柑橘亞族無(wú)融合生殖的雜合MITE插入

為了研究柑橘無(wú)融合生殖決定區(qū)的遺傳變異模式，基于單倍型構(gòu)建了313 Kb區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5b）。結(jié)果表明，柑橘存在多種無(wú)融合生殖現(xiàn)象。同一個(gè)體的兩個(gè)單倍型并不總是聚集在同一分支中，這表明不同群體中無(wú)融合生殖的起源不同。前期研究表明，在CitRWP基因啟動(dòng)子中插入的MITE與無(wú)融合生殖相關(guān)。作者將PCR和循環(huán)一致性測(cè)序（CCS）相結(jié)合，以闡明FhRWP啟動(dòng)子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。結(jié)果證實(shí)，MITE的插入與無(wú)融合生殖和無(wú)融合生殖單倍型密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，不同數(shù)量的MITE及其不同的序列表明無(wú)融合生殖等位基因可能起源不同；MITE插入在雜合子狀態(tài)下非常常見(jiàn)，這可能與無(wú)融合生殖品種的單倍型差異有關(guān)。

與FhRWP中MITE相互作用的因素

通過(guò)細(xì)胞學(xué)分析珠心胚的起始過(guò)程，無(wú)融合生殖山金柑的胚珠在開花時(shí)明顯，但在有性生殖山金柑中不明顯（圖6a）。轉(zhuǎn)錄組分析表明，在開花前7天和開花后7天兩個(gè)時(shí)期，有MITE插入的無(wú)融合生殖單倍型中均檢測(cè)到FhRWP表達(dá)，但在無(wú)MITE插入的有性生殖材料中未檢測(cè)到表達(dá)（圖6b）。在開花后0、3、5、10和20天的五個(gè)發(fā)育階段的RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)了這一結(jié)果。

甲基化及酵母單雜分析進(jìn)一步的探索了FhRWP基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)因素，鑒定了一種轉(zhuǎn)錄因子FhARID（Fh3g37720），位于與無(wú)融合生殖區(qū)不同的染色體上，該轉(zhuǎn)錄因子編碼一個(gè)富含AT的相互作用域的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)結(jié)合到FhpMITE右側(cè)片段（圖6h）。FhARID在無(wú)融合生殖的山金柑胚珠中特異表達(dá)。為了研究MITE類序列的數(shù)量是否對(duì)FhARID誘導(dǎo)的FhRWP表達(dá)激活很重要，作者構(gòu)建了具有一個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)pMITE序列拷貝的啟動(dòng)子，并通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行了雙熒光素酶測(cè)定。結(jié)果表明，FhARID結(jié)合pMITE序列并激活連鎖報(bào)告基因表達(dá)，但pMITE序列的數(shù)量在FhARID介導(dǎo)的激活中沒(méi)有顯示出顯著差異。

?

研究小結(jié)

該研究團(tuán)隊(duì)利用山金柑品系Sy3-45為材料進(jìn)行了高質(zhì)量染色體級(jí)別基因組的組裝和遺傳群體構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了金柑屬無(wú)融合生殖關(guān)鍵基因的定位。結(jié)合柑橘不同屬材料的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步解析了金柑屬和柑橘屬無(wú)融合生殖表型的平行進(jìn)化機(jī)制。該研究發(fā)現(xiàn)，雜交起源的柑橘群體能夠通過(guò)無(wú)融合生殖來(lái)保持雜交優(yōu)勢(shì)，并導(dǎo)致無(wú)融合生殖的關(guān)鍵MITE插入以雜合子形式存在，首次提出了無(wú)融合生殖在柑橘分化和馴化過(guò)程中的重要作用。

如果您的項(xiàng)目需要PacBio、Hi-C測(cè)序服務(wù)，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費(fèi)為您進(jìn)行文章思路方案設(shè)計(jì)。