單細胞轉錄組解析結直腸癌與肝轉移之間的免疫表型

研究背景

本研究對來自肝轉移性結直腸癌的樣本進行了單細胞分析，以解釋了影響TME的因素。通過對不同組織中的CD45⁺細胞分析，發(fā)現(xiàn)M型T細胞表型與惡性腫瘤相關，而N型表型與生態(tài)位相關。樹突狀細胞（DC3s）和SPP1⁺巨噬細胞的一個亞群也是M型，在肝轉移中占優(yōu)勢，表明其具有促轉移的作用。本研究將原發(fā)性和轉移性腫瘤的免疫表型聯(lián)系起來，從而有助于了解腫瘤特異性。

研究材料

材料：結直腸癌患者17例，其中女性6例，男性11例。患者手術切除來自原發(fā)性腫瘤和肝轉移的新鮮腫瘤和鄰近正常組織樣本（距匹配的腫瘤組織至少2 cm）

方法：單細胞轉錄組測序

研究成果

1、CRLM、HCC和CRC的數(shù)據(jù)收集和不同的免疫特征

從101個匹配的CRLM樣本中分選出CD45⁺細胞，包括原發(fā)性結直腸癌（Pri.CT）、鄰近結腸（Adj.Col）、腸系膜淋巴結（MLN）、肝轉移（Liv.Mets）、鄰近肝臟（Adj.Liv） 和17名初治患者的外周血（圖1A），分別獲得323,444和5,004個高質量細胞，包括CD4⁺和CD8⁺ T細胞、單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷T（NKT）細胞、NK細胞、γδ T細胞、DC、肥大細胞、B細胞、3型先天性淋巴細胞（ILC3）和少量 CD45-細胞，此外，共鑒定出78個免疫細胞亞群（圖1B和1C）。由于原發(fā)性HCC/CRC和CRLM腫瘤同時分析TME 形成過程中的相互作用至關重要，因此本研究結合了來自18名未接受治療的非轉移性CRC患者的49個樣本和51個樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)集。

僅對來自原發(fā)性HCC/CRC的正常和腫瘤數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，發(fā)現(xiàn) CD4_Treg-CTLA4、CD8_Tex-LAYN和Mph-C1QC是腫瘤相關的前三個簇（p < 0.001，ANOVA檢驗；圖2A），并且在HCC和CRC腫瘤相應的鄰近部位（圖2B），這表明這些細胞可能受到惡性腫瘤狀態(tài)的影響。此外，與Adj.Cols和HCC腫瘤相比，Mph-SPP1在CRC腫瘤中富集（圖2B）。KLRB1⁺組織駐留記憶（Trm）CD8⁺?T和MAIT細胞在HCC腫瘤和Adj.Livs中占優(yōu)勢，而上皮內(nèi)淋巴細胞（IEL）和Mph-NLRP3在CRC腫瘤和Adj.Cols中表現(xiàn)出更高的豐度（圖2A），這表明這些細胞可能受到所在組織的影響。

2、通過PhenoAligner解開癌細胞和宿主器官對TME的影響

使用來自Pri.CT、Adj.Col、MLN、Adj.Liv和血液的單個細胞作為參考，并將來自 Liv.Mets的每個免疫細胞與參考對齊，以識別其相鄰的組織類型（圖2C）。對于Liv.Mets中的特定簇，具有高PhenoAligner指數(shù)的組織類型可能表明Liv.Mets中的高比例細胞在所識別的組織類型中具有相似的居住位。

在主要免疫區(qū)室水平中，PhenoAligner顯示Liv.Mets中81% CD45^–細胞與Pri.CT中的細胞對齊（r>0.5，Pearson相關性；p<0.05，置換檢驗）（圖2D）。來自原發(fā)性腫瘤的肥大細胞被稱為“惡性腫瘤相關”（因此稱為“M型”）；Liv.Mets中的NKT和NK細胞與Adj.Liv的免疫微環(huán)境密切相關，但與其他組織無關，被表征為“生態(tài)位相關”（因此稱為“N型”），同樣，DC和γδ T細胞被鑒定為N型；此外，Liv.Mets中的單核細胞和巨噬細胞與Pri.CT和Adj.Liv具有顯著聯(lián)系，其表型被表征為“組合相關”（因此稱為“C型”）（圖2D）。

3、CD8⁺?Texs與惡性腫瘤相關

盡管Liv.Mets中的CD8⁺?T細胞被指定為N型，但基于PhenoAligner分析（圖3 A和3B），它們的子集顯示出不同的模式。在所有CD8⁺?T簇中，Tex-LAYN和Tex-MKI67被鑒定為M型（圖3A）。Tex-MKI67與Tex-LAYN共享多個T細胞受體（TCR）克隆型和相似的基因表達。因此，Texs主要受惡性細胞的影響。

從10×5′ VDJ數(shù)據(jù)中獲得了TCR信息，以識別Liv.Mets和Pri.CT之間的共享TCR，在Pri.CT和Liv.Mets中分別檢測到的172和149種TCR克隆型中，42種在兩個腫瘤部位共享（圖3C和3E），表明Tex表現(xiàn)出惡性腫瘤排他性并包含可能識別腫瘤抗原的TCR。另外，Pri.CT和Liv.Mets之間共享的Texs TCR克隆型也可以在血液中的效應記憶T細胞（Temras）中檢測到，這表明血液中的Temra克隆可能會滲入Pri.CT和Liv.Mets。效應記憶T細胞（Tems）和Texs之間觀察到更高程度的TCR共享。RNA速度分析發(fā)現(xiàn)Temras和Tems之間的雙向流動（圖3F）。這些觀察表明，Tems表現(xiàn)出高度可塑性和中間性質，Tems的這種中間轉變可能是CD8⁺?T細胞腫瘤浸潤過程中的一個重要橋接步驟，并且可以為先前提出的癌癥-免疫周期增加新的見解（圖 3 G）。

4、結直腸惡性腫瘤和肝臟生態(tài)位對CD4⁺?T細胞亞群有不同的影響

對CD4⁺?T細胞進行了類似的分析，并觀察到Th17、Th1、Treg-IL10和Treg-CTLA4被表征為M型（圖4A和4B）。在組織富集的Treg群體中，Treg-IL10高度表達腸道常駐Treg標志物，包括IL10、IL23R和IL1R1（圖4 C）；Treg-CTLA4高表達基因包括LAYN、CCR8和TIGIT（圖4C）。此外，與非轉移性CRC腫瘤相比，CRLM患者Pri.CT中Treg-IL10和Treg-CTLA4的比例顯著增加（圖4D），表明與非轉移性CRC腫瘤相比，具有Liv.Mets的原發(fā)性CRC腫瘤可能表現(xiàn)出更強的免疫抑制生態(tài)位。

Treg-CTLA4和Th1細胞中的TCR在Pri.CT和Liv.Mets之間顯著共享（圖4F和4E）。在所有CD4⁺?T細胞簇中，只有Treg-CTLA4在Pri.CT和Liv.Mets之間的STARTRAC-migr指數(shù)高于腫瘤和其他組織之間的指數(shù)（圖4H）。此外，RNA速度分析顯示從Treg-FOXP3到Treg-CTLA4的轉變方向（圖4I），表明血液中靜止的Tregs可能遷移到兩個腫瘤部位，然后在TME中被激活和擴張。Treg-IL10和Th17的TCR在Pri.CT和Liv.Mets之間表現(xiàn)出互斥模式（圖4G）。這些觀察表明，Liv.Mets中Treg-IL10和Th17的表型可能是由類似于腸道相關環(huán)境的組織生態(tài)位誘導的。

5、SPP1⁺?TAMs在Liv.Mets中的作用

對巨噬細胞的異質性進行分析。得到14個亞群，大多數(shù)被表征為N型或C型，只有3個TAM簇被表征為M型（圖5A）。雖然SPP1⁺?TAM的表達特征通常存在于非轉移性CRC hM13_TAM_SPP1中，但這種特征在非轉移性HCC巨噬細胞中基本上不存在（圖5B），可SPP1⁺?TAMs在Liv.Mets中占主導地位（圖5C）。使用bulk RNA-seq數(shù)據(jù)（GEO：GSE14297）證實，SPP1基因在Liv.Mets中高表達（圖5D）。IHC也證實了該TAM亞群在 Liv.Mets（圖5H）中。

接下來評估了這3個M型TAM亞群的血管生成和吞噬特性。SPP1⁺?TAMs顯示出*高的血管生成評分，而C1QC⁺?TAMs顯示出*高的吞噬作用評分（圖5G）。結果證明了SPP1⁺主要存在于Liv.Mets中以及C1QC⁺的增殖特征，暗示它們在轉移過程中的重要作用。

6、促炎性DC3在表型上由CRLM中的癌細胞形成

在CRLM患者中鑒定了10個DC亞群，并根據(jù)ROGUE指數(shù)計算了它們的純度（圖6A）。Liv.mets中的cDC2- C1QC細胞被表征為M型，而Liv.mets中的cDC2-TIMP1細胞被表征為C型，因為它們與Adj.Liv和MLN相關（圖6B），這些觀察表明這兩個cDC2可能在Liv.Mets中具有不同的功能?；诓町惐磉_分析，cDC2-C1QC表現(xiàn)出更高的C1QA、CD68、CD163和CD14表達（圖6C和6E）。cDC2-TIMP1高度表達成熟標志物，如CCR7 和血管生成相關基因，包括EREG、CREM和VEGFA（圖6D和6E）。

最后，比較了CRLM、HCC和CRC數(shù)據(jù)集之間DC的差異（圖6F）。與Liv.Mets和非轉移性CRC腫瘤相比，DC3在CRLM的Pri.CT中顯示出更高的頻率（圖6G）?；趯?TCGA、COAD和READ隊列的生存分析，cDC2中DC3的比例與預后不良相關（圖6H）。IHC進一步證實了DC3s的存在（圖6I和6J）。

研究結論

• 描述了結直腸癌和肝轉移的免疫細胞表型
• 惡性腫瘤相關的耗竭和調節(jié)性T細胞表現(xiàn)出不同的TCR依賴性
• SPP1⁺TAMs與惡性腫瘤相關并與肝轉移有關
• DCs主要與宿主器官相關

 

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