代謝物與表型最為接近！一方面，代謝物能反映生物體的真實生理狀態(tài)，代謝物的變化直接導(dǎo)致表型的變化。相比于其他組學(xué)，代謝組受環(huán)境影響較大，環(huán)境對生物體的影響也是體現(xiàn)為代謝物的變化。但是單獨代謝組檢測，無法解釋影響表型的基因機理，相反，轉(zhuǎn)錄組的表達不能直接證明表型是否發(fā)生變化。為了結(jié)合轉(zhuǎn)錄和代謝的優(yōu)勢，我們可以進行轉(zhuǎn)錄組+代謝組的聯(lián)合分析，同時實現(xiàn)從“因”和“果”兩個層面來探究生物學(xué)問題，相互間進行驗證，從海量的數(shù)據(jù)中篩選出關(guān)鍵基因、代謝物及代謝通路，深度解析生物系統(tǒng)的宏觀發(fā)育過程，解釋生物過程的復(fù)雜性和整體性。
代謝物是植物表型（功能）的物質(zhì)基礎(chǔ)，園藝植物包括水果、蔬菜、花卉等，具有豐富的顏色性狀和品質(zhì)性狀，這些性狀和功能的物質(zhì)基礎(chǔ)是研究的熱點方向。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院張凌云老師團隊近期在《Frontiers in plant science》上發(fā)表關(guān)于代謝組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析，揭示了茶樹BP型色澤與香氣的關(guān)系，確定了花青素運輸相關(guān)途徑中的基因表達譜。
研究背景
苯類化合物，尤其是苯丙烷，是植物顏色和香氣的主要來源，它們幫助植物吸引傳粉動物或阻止外敵侵害。類苯和類苯丙烷（BPs），例如類黃酮，是一組次級代謝產(chǎn)物，來源于莽草酸途徑中的兩種芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸。
茶葉之所以成為一種受歡迎的非酒精飲料，其多樣性和豐富的香氣是兩個原因。茶葉中的主要揮發(fā)性BPs為2-PE、Balc和MeSA，而AP和1-PE在茶花中是獨特的。揮發(fā)性BPs和非揮發(fā)性BPs有一個共同的上游合成途徑。它們都來源于苯丙氨酸，苯丙氨酸是由莽草酸途徑產(chǎn)生的，苯丙氨酸分別進入苯丙氨酸代謝和合成途徑。前者繼續(xù)形成揮發(fā)性BPs，后者形成類黃酮，包括花青素。研究BP色素和香氣的理想材料盡量是含有盡可能多的花青素和揮發(fā)性BP。紫娟是一個特殊的茶樹品種，有紫色的芽、莖和葉，但仍然缺乏AP和1-PE。此外，和其他茶葉品種一樣，紫娟的花也是白色的，這意味著花青素的含量較低。然而在中國廣東省白塘鎮(zhèn)的茶園里找到了一份完美的材料，一種自然突變的品種（BT；C.sinensisvar.Baitang）有紫色的葉子和花。這個品種為研究BPs在茶樹中的代謝以及BPs引起的色香味關(guān)系提供了更好的模型。
作者將茶花重新劃分為三個階段，即成熟花蕾（階段1）、開花前（階段2）和開花（階段3）。此外，花香一般會在開花后大量釋放，考慮到早期花青素的形成和香氣的量，該研究選擇了階段2作為實驗對象。
在這項研究中，為了研究揮發(fā)性和非揮發(fā)性BPs對紫色茶花的氣味和顏色的作用，在白色（ZJ品種）和紫色（BT品種）茶花瓣中測定了BP型香氣和花青素（圖1），確定了生物合成和花青素運輸相關(guān)途徑中的基因表達譜，并分析了調(diào)節(jié)ZJ和BT之間氣味和顏色變化可能的TFs。
圖1?檢測到白色和紫色茶花及其主要苯類-苯丙烷（BPs）的結(jié)構(gòu)
實驗材料與方法
實驗材料：在廣東省白塘鎮(zhèn)的茶園中培育了紫茶花BT和白花茶花ZJ。采摘第2階段（開花前）的花朵，收集花瓣液氮速凍，-80℃保存。
實驗方法：百邁客轉(zhuǎn)錄組測序平臺：Illumina HiSeq 2500，紫茶花BT和白花茶花ZJ各3各生物學(xué)重復(fù)。代謝組：GC-MS
主要結(jié)果與分析
在白色和紫色茶花中，最豐富的揮發(fā)性苯化合物（BPs）是MeSA和AP、1-PE。在白色茶花中，MeSA是主要的揮發(fā)性BPs，相對于白色茶花，紫色茶花中的AP高出2倍。除MeSA外，其他常見揮發(fā)性BPs在紫色花朵中顯著升高：1-PE、Bald和Balc分別為高出2,2.9,2.8倍；而在白花中沒有檢測到2-PE?？傮w上，紫茶花中的BPs發(fā)生了變化，其中苯丙烷類（AP、1-PE和2-PE）高于其他苯類（Bald、Balc和MeSA），而在正常的白色花朵中，則相反，這表明紫色茶花中苯丙烷類化合物的合成途徑被促進。
然后，作者研究了四種直接合成苯甲酸芐酯、MeSA、2-PE和AP的基因，分別是苯甲醇鄰苯甲酰轉(zhuǎn)移酶（BPBT；KO id為K19861）、水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶（SAMT；KO id為K21483）、苯乙醛還原酶（PAR）和短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）。他們都在紫色茶花中高表達。通過柱狀圖分析了兩個品種之間存在顯著差異的22個SDR基因成員。在紫色茶花中，22個SDR基因的總表達量高出1.3倍，其中表達水平高的成員（TEA025281）也是如此。BPBT和PAR表達水平較低，分別為15和5倍。兩個SAMT成員在茶花中高度誘導(dǎo)，在紫色花瓣中高出3-4倍。這些結(jié)果證明紫茶花中揮發(fā)性BPs的生物合成能力更強。
圖2白色和紫色茶花中揮發(fā)性苯丙酸（BPs）及其相關(guān)基因的含量
在這兩個品種的花瓣中共檢測到20種花青素，其中5種花青素為苷元，分別為Pg、Cy、Dp、Pn和Pt。兩種花色茶花中都有兩到三種花色苷未檢測到，即：白色茶花中的petunidin-3-O-(6’’-O-p-coumaroyl)glucoside-5-O-rhamnoside，cyanidin-3-O-(6’’-O-caffeoyl-2’’-O-xylosyl)glucosid和pelargonidin-3-O-glucoside
，以及紫色茶花中的cyanidin-3-O-(6’’-O-p-coumaroyl)rutinoside-5-O-glucoside ?和cyanidin-3-O-caffeoylsophoroside（圖3A）。這20種花青素的總含量紫色花瓣比白色花瓣高1.9倍。根據(jù)苷元類型，20種花色苷可分為2個Pg、11個Cy、1個Dp、2個Pn和4個Pt，其中Cy和Dp是主要的苷元（圖3B）。
Dp只有一種糖苷形式，但它在紫色花瓣中含量豐富。紫色花瓣中的主要花色苷是delphinidin-3-O-glucoside，Cy-3-O-(6’’-O-p-coumaroyl)glucoside, ?Cy-O-syringic ?acid， Cy-3-O-glucoside和Cy-3-O-galactoside，?而在白色茶花中，則是 Cy-3,5-O-diglucoside， Pt-3-O-glucoside-O-arabinoside，? Cy-3-O-(2’’-O-glucosyl)glucoside和 Cy-3-O-rutinoside 。除苷元外，這20種花青素中的另一半含有13種糖苷和1種丁香酸（圖3C）。在白色花瓣中，花青素含量高的是3,5-O-二葡萄糖苷，而在紫色花瓣中，3-O-葡萄糖苷含量極高。因此，兩個茶樹品種之間花青素的大差異是DpG，這可能是紫色花呈紫色的主要原因，以及紫色花瓣中Dp和葡萄糖的生物合成可能已增強。
為了研究花青素生物合成過程，作者對ZJ和BT兩個品種的花瓣進行了轉(zhuǎn)錄組測序。類黃酮生物合成途徑表達譜分析發(fā)現(xiàn)每個基因都有多個成員，其中一些在白色花瓣中較高，而另一些則相反（圖4）。然而，根據(jù)每個基因中存在顯著差異的成員的表達總和，發(fā)現(xiàn)紫色花瓣中的大多數(shù)基因表達下調(diào)，尤其是C4H、FLS、LAR和ANR，表達顯著降低，但F3’H和F3’5’H明顯上調(diào)，特別是F3’5’H被提高了8倍，這證明了它在產(chǎn)生Dp中的關(guān)鍵作用。此外，由于ANR的含量很低，Dp不能還原為表兒茶素，因此不能被用于合成DpG，而DpG是由bronze-1（BZ1）催化的。BZ1是一種花青素3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，也稱為UFGT。BZ1基因成員在紫色花瓣中的總表達水平是白色花瓣的3倍。
為了進一步揭示兩個茶樹品種之間BPs的不同合成機制，檢測了上游化合物和基因（圖5）。在紫色花瓣中，3-磷酸甘油醛（GA3P）增加了2.9倍，而磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）僅為白色花瓣的38%，這表明紫色花瓣中的碳代謝被促進，但它可能不會進入苯丙氨酸的下游代謝。PEP的降低可能是由于高度誘導(dǎo)的3-脫氧-D-阿拉伯庚糖酸7-磷酸合成酶（DAHPS）所致。在紫色花瓣中，DAHPS基因的主要成員TEA028537的表達量高出4.6倍。芳醇脫水酶/預(yù)苯酸脫水酶（ADT）催化芳醇生成苯丙氨酸。它的主要成員TEA033282在紫色花瓣中略微升高，高出1.3倍。此外，合成的花青素在顯示顏色之前需要運輸?shù)揭号葜?，該過程與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）以及多藥和毒素擠壓（MATE）有關(guān)。把這些顯著差異基因的表達量加起來，發(fā)現(xiàn)紫色花瓣的總表達量都較高，分別高出1.1， 1. 3和1.7倍。紫色花瓣中這三個基因的主要成員（TEA015341、TEA001531和TEA006958），表達量分別高出6.9, 1. 4，和3.9倍。
圖3 非揮發(fā)性BPs在白色和紫色茶花之間的差異（p<0.05）。（A） 所有花青素的峰面積；（B）同一苷元的聚集；（C）相同糖基的聚集
圖4花青素生物合成相關(guān)基因的表達水平
圖5 BPs上游生物合成途徑中的關(guān)鍵化合物和基因，以及與花青素運輸相關(guān)的基因在白色和紫色之間的表達量差異
?參與苯類-苯丙烷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子
上述結(jié)果表明，在紫色花朵中，具有特征的揮發(fā)性和非揮發(fā)性BPs分別為AP和DpG。計算了Ps和TFs之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)這兩個茶葉品種之間存在顯著差異。AP和DpG的14個TF的相關(guān)系數(shù)大于0.95（表1）。他們屬于AP2/ERF、bZIP、EMP、GATA、HS、MYB、NAC、TCP和WRKY家族，在紫色花種分別高出1.6–6.7倍，其中MYB、AP2/ERF、bZIP、TCP和GATA的表達水平高。
作者分析了14個TFs與上述結(jié)構(gòu)基因之間的相關(guān)性，以發(fā)現(xiàn)潛在的調(diào)節(jié)機制（圖6）。大多數(shù)TFs與PAR、SAMT和SDR高度相關(guān)，這有助于揮發(fā)性BPS合成；以及4CL、BZ1、CHS、F30H、F3050H、FLS和LAR，它們有助于非揮發(fā)性BPs合成；以及ADT和DAHP在苯丙氨酸上游生物合成中起作用。相比之下，這些TFs并不關(guān)注花色素苷運輸?shù)奶囟ɑ颉?/p>
圖6轉(zhuǎn)錄因子（TFs）和結(jié)構(gòu)基因之間的相關(guān)性 表1 候選轉(zhuǎn)錄因子（TFs）參與苯乙酮（AP）和delphinidin-3-O-葡萄糖苷（DpG）的生物合成
總 結(jié)
研究發(fā)現(xiàn)在BT紫色花瓣中，BP型香氣隨著BP型顏色的出現(xiàn)而增加。AP和DpG大量累積，是主要的揮發(fā)性和非揮發(fā)性BPs，此外莽草酸途徑中的結(jié)構(gòu)基因和揮發(fā)性BPs的合成得到了促進。類黃酮合成途徑的大多數(shù)基因被下調(diào)，并且流出被引導(dǎo)積累Dp。許多TF參與調(diào)節(jié)紫色及其相關(guān)香氣。該研究結(jié)果揭示了茶樹BP型色澤與香氣的關(guān)系，為了進一步闡明調(diào)控機制，未來需要對相關(guān)基因的功能進行更多的鑒定。
圖8 紫色與白色茶花中BPs合成相關(guān)基因的表達譜比較；綠色和紅色箭頭分別表示紫色花瓣中較低和較高的部分
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