雜志：BMC Genomics
影響因子：3.594
研究背景
龍眼(Dimcarpus Longan?Lour.)為無患子科熱帶/亞熱帶常綠果樹，原產(chǎn)于中國南部和東南亞，現(xiàn)已在東南亞、南亞、澳大利亞和夏威夷等地廣泛種植。龍眼胚發(fā)育狀況與種子大小、座果率、果實產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。由于其高度的遺傳雜合性和在體內(nèi)獲取早期胚胎的困難，在分子水平上闡明胚胎發(fā)育機制仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。植物體細胞胚胎發(fā)生（SE）幾乎在所有發(fā)育階段都與正常合子胚胎發(fā)生有密切的相似性，SE已被廣泛用于研究植物早期胚胎發(fā)生的分子調(diào)控機制研究中。在過去的幾年里，利用RNA-seq測序技術(shù)挖掘了棉花、擬南芥、玉米、挪威云杉、椰子、巴西松、樟樹、草莓、水稻、小百合、山竹、番木瓜和小麥等不同物種SE相關(guān)基因及調(diào)控模式，最近，龍眼基因組草圖序列問世，為研究SE的分子調(diào)控提供了全面的基因組信息。從非胚性愈傷組織(NEC)到胚性愈傷組織(EC)，從EC到體細胞胚的轉(zhuǎn)變是SE的關(guān)鍵步驟。然而，龍眼SE過程中的分子調(diào)控機制在很大程度上還不清楚。
材料方法
轉(zhuǎn)錄組測序材料：龍眼NEC、EC、不完全致密原胚性組織(ICpEC)和球形胚(GE)組織，每組3個生物學重復；
測序平臺：Illumina HiSeq? 2000
QRT-PCR驗證：龍眼NEC、EC、ICpEC、GE、魚雷狀胚(TE)和子葉胚(CE)
研究結(jié)果
- RNA-Seq 與基因組比對分析
為了在轉(zhuǎn)錄水平上全面了解龍眼SE，作者對四個體外胚胎發(fā)育階段(NEC、EC、ICpEC和GE)進行了測序。去除低質(zhì)量序列后，共獲得了243,783,126 clean reads，在與龍眼參考基因組比對后，4個cDNA文庫分別有48,798,229(81.62%)，52,623,741(81.1%)，48,346,067(81.14%)和48,871,200(82.08%)測序數(shù)據(jù)比對到龍眼參考基因組。其中44,655,772個(74.69%)，48,333,703個(74.50%)，44,490,292個(74.67%)，44,924,511個(74.45%)唯一比對。同時，4個cDNA文庫中分別有34,380,246(57.51%)，35,386,494(54.54%)，30,535,088(51.25%)和29,214,788(49.07%)個比對到基因。4個文庫分別產(chǎn)生了22743、19745、21144和21102個轉(zhuǎn)錄本，過濾掉小于180bp的短序列和低于2的低測序深度序列后，在4個樣本中分別檢測到1935、1710、1816和1732個新基因。其中1025、819、832和806個為編碼RNA。4個階段共檢查到130,354個AS事件，包括外顯子跳躍、內(nèi)含子保留、5’可變剪接和3’可變剪接。檢出AS事件多的是GE(39,768)，其次是ICpEC(36,446)和NEC(35,084)，EC少(19,056)。外顯子跳躍是所有樣本中少的剪切類型，內(nèi)含子保留是NEC、ICpEC和GE中常見的AS事件類型。
圖1 可變剪切類型分析
- 基因表達分析
NEC、EC、ICpEC和GE期分別有22743，19745，21144和21102個基因表達。其中，75.3%以上的基因在4個發(fā)育階段均有表達，2645個基因僅在NEC中表達。然而，在EC、ICpEC和GE階段中特有表達基因只有366、505和588個，這表明在這四個發(fā)育過程中存在著不同的空間轉(zhuǎn)錄模式。通過RSEM軟件將基因表達歸一化為FPKM，以FPKM>60篩選高表達基因，NEC、EC、ICpEC和GE中高表達基因分別為2961個(11.40%)、3445個(13.26%)、3445個(13.26%)和3442個(13.25%)。與SE相關(guān)的基因LEC1、L1L、PDF1、LTP、HSP90等在EC、ICpEC和GE中高表達。
為了揭示與早期SE相關(guān)的基因表達信息，作者以|log2Fold Change|≥1和FDR<0.001為閾值，篩選差異表達基因(DEG)，四組比較如下：NEC_VS_EC、EC_VS_ICpEC、EC_VS_GE和ICpEC_VS_GE，分別篩選出10642，4180，5846和1785個差異表達基因。與NEC相比，EC有4887個基因表達上調(diào)，5755個基因表達下調(diào)。與EC相比，ICpEC有2689個上調(diào)基因和1491個下調(diào)基因，GE有3451個上調(diào)基因和2395個下調(diào)基因。與ICpEC相比，GE有832個基因表達上調(diào)，953個基因表達下調(diào)。DEGs分析表明，龍眼轉(zhuǎn)錄組在SE過程中發(fā)生了顯著的動態(tài)變化，特別是在NEC向EC的過渡期。因此，本文提供的龍眼SE轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可能為今后的研究提供了有價值的分子資源。
圖2 差異表達基因分析
- 差異基因的GO與KEGG分析
為了評估DEGs的潛在功能，作者使用GO數(shù)據(jù)庫對差異基因進行注釋，在所有分組中，在biological process中所占比例大的是“代謝過程”，“細胞過程”、“單個生物過程”、“對刺激的反應”和“定位”，在cellular component中所占比例是“細胞”和“細胞部分”，“細胞器”和“膜”，在“molecular function”中所占比例大的是“催化活性”、“轉(zhuǎn)運蛋白活性”、“分子轉(zhuǎn)導活性”和“核酸”。作者利用KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs的功能進行了分類，重點是生物學途徑。根據(jù)KEGG注釋，將6516個DEGs (NEC_VS_EC)注釋到128個通路，將2514個DEGs (EC_VS_ICpEC)注釋到126個通路，將3555個DEGs (EC_VS_GE)注釋到126個通路，將1062個DEGs (ICpEC_VS_GE)注釋到111個通路。這些通路主要集中在“代謝途徑”、“次生代謝物的生物合成”、“植物-病原菌相互作用”和“植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑”。此外，還有數(shù)十個基因參與了“類黃酮生物合成”、“苯丙烷生物合成”、“玉米素生物合成”、“脂肪酸生物合成”和“不飽和脂肪酸生物合成”。
- 植物激素信號通路及類黃酮和脂肪酸生物合成相關(guān)基因分析
根據(jù)KEGG注釋信息，植物激素相關(guān)基因顯著差異，EC與NEC和早期SE相比，生長素和細胞分裂素生物合成和信號轉(zhuǎn)導途徑的基因顯著差異表達。在生長素生物合成中，除PAI外，色氨酸合成關(guān)鍵基因ASA、IGS、TSA、TSB在EC中表達上調(diào)，并在SE早期保持高表達。此外，參與脫落酸、赤霉素、乙烯、水楊酸、茉莉酸和油菜素甾體信號轉(zhuǎn)導途徑的眾多基因在龍眼SE中也有差異表達。這樣的觀察表明，激素及其復雜的通路在SE早期起著重要作用。因此，植物激素信號通路可能是龍眼早期SE的關(guān)鍵調(diào)控因子。
類黃酮生物合成和脂肪酸生物合成是KEGG的代表途徑，在早期的SE過程中，共有125個顯著的DEG被注釋為“類黃酮生物合成”相關(guān)基因。在由NEC向EC過渡的過程中，類黃酮生物合成關(guān)鍵基因主要在NEC中表達，此外，大多數(shù)FLS和F3’H家族主要在NEC中表達，在EC中表達顯著下調(diào)。11個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄差異表達。在龍眼SE期間，MYB12和MYB111在NEC中幾乎沒有表達，從NEC到EC表達顯著上調(diào)，在SE早期保持較高水平。MYB75、MYB113、MYB4和MYB123在EC中表達顯著下調(diào)，在SE早期維持相對較低表達。共有35個脂肪酸生物合成相關(guān)基因在SE過程中差異表達。
圖3 類黃酮生物合成途徑分析
5.胞外蛋白編碼基因及SE分子標志物篩選
? ? ? 已有研究表明，GLPs、AGPs、CHIs、LTPS和糖蛋白對SE起關(guān)鍵作用，可作為SE早期的蛋白質(zhì)標志物。在本研究中，共有有16個CHI在NEC中有差異表達，其中大部分在NEC中較高表達，在EC中顯著下調(diào)。大部分LTP主要在NEC中表達，從NEC到EC表達下調(diào)。同時，12個GLP和2個分泌型糖蛋白(EP1-like)主要在NEC表達，并且在SE早期維持很低的FPKM。結(jié)果表明，大部分胞外蛋白編碼基因主要在NEC中表達，推測它們可能參與了NEC向EC的轉(zhuǎn)變。
為了研究龍眼早期SE分子標記的全面性，本研究通過對龍眼根、莖、葉、花、花蕾、幼果、果皮、果肉和種子等9個組織中的FPKM進行比較分析，篩選出SE早期的分子標記基因。作者發(fā)現(xiàn)共有55個基因被鑒定為與SE密切相關(guān)的代表性分子標記，依據(jù)它們在所有測試樣本中的特異性表達譜，可以分為兩大類：NEC標記和SE分子標記。SE標記基因在NEC中幾乎檢測不到，在SE早期高表達，也可分為SE特異性基因和SE高表達基因。SE特異性基因僅在體細胞胚中高轉(zhuǎn)錄，包括LEC1、LEC2、WOX9、WOX2等。這些SE特異性基因可能在龍眼SE中起關(guān)鍵作用。SE高表達的基因與SE特異性基因相似，不同之處在于這些基因在本研究的一個或幾個被測組織中也高表達，包括ABI3、FUS3、PDF1.3等。相反，28個有代表性的NEC標記基因在NEC中高表達和特異表達，包括LEA5、CNOT3等。
6.QRT-PCR驗證
作者對16個分子標記在包括NEC、EC、ICpEC、GE、TE、CE在內(nèi)的組織中進行QRT-PCR驗證，根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，所有選定的基因在不同發(fā)育階段都有不同水平的表達。DlLEC1、DlPDF1.3、DlGH3.6、DlPIN1、DlWOX9、DlWOX2、DlGIF2、DlRGF3、DlPLT2和DlAGL80在NEC中幾乎未檢測到，在EC中表達高，然后在SE中表達下調(diào)，在TE和CE中表達相對較低，表明這些分子標記在EC的誘導和維持中起重要作用。DlL1L、DlBBM、DlABI3和DlLTP在SE過程中高表達或上調(diào)，在NEC中低表達或未發(fā)現(xiàn)表達，表明這些標記基因可能正向調(diào)控龍眼SE的發(fā)育。此外，DlLEA5和DlCHI的轉(zhuǎn)錄水平在NCE中高度特異表達，可能是NEC向EC轉(zhuǎn)化的抑制因子。SE相關(guān)基因的qRT-PCR驗證也顯示RNA-seq和QRT-PCR數(shù)據(jù)之間高度相似。
圖4 QRT-PCR驗證
總結(jié)
作者研究建立了龍眼SE的高分辨率轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集。對早期SE階段表達模式的比較分析提供了調(diào)控龍眼SE的DEG亞群。揭示了植物激素相關(guān)基因如生長素和細胞分裂素信號途徑、類黃酮和脂肪酸生物合成途徑、胞外蛋白以及具有代表性的分子標記基因在龍眼SE中的表達譜，表明它們可能在龍眼SE中發(fā)揮作用。這些轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)為未來的功能研究提供了新的見解。
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