韓永超博士團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)DMI類(lèi)殺菌劑對(duì)炭疽菌無(wú)性繁殖的促進(jìn)作用

研究背景

由真菌侵染引起的作物病害每年在全世界造成約20%的產(chǎn)量損失，收獲后還會(huì)造成10%的損失。真菌對(duì)人類(lèi)健康的影響目前呈螺旋上升趨勢(shì)，真菌疾病的全球死亡率現(xiàn)已超過(guò)瘧疾或乳腺癌，與結(jié)核病和艾滋病毒的死亡率相當(dāng)。化學(xué)防治是控制引起作物和動(dòng)物疾病的真菌病原體的最重要措施之一。然而，隨著殺菌劑的廣泛使用，出現(xiàn)了許多問(wèn)題，其中最重要的是真菌耐藥性和殺菌劑殘留。目前，對(duì)于植物病原體而言，許多地區(qū)的白粉病、紋枯病、鐮刀菌穗枯病和小麥赤霉病對(duì)常用殺菌劑的抗性頻率已導(dǎo)致化學(xué)防治效果的下降或失敗。在人類(lèi)中，高危患者長(zhǎng)期的預(yù)防性治療同樣會(huì)導(dǎo)致真菌耐藥性的出現(xiàn)。為了提高防治效果，農(nóng)民盲目提高施用頻率或不加區(qū)別地使用各種登記范圍外農(nóng)藥，這是我國(guó)農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染的主要來(lái)源。關(guān)于施用后殺菌劑的影響，之前的研究主要集中在農(nóng)藥殘留對(duì)水果和蔬菜的有害影響；殺菌劑在處理后的殘留,尤其是它們?cè)谀繕?biāo)真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢中的潛在作用很少受到關(guān)注。

草莓炭疽病是一種嚴(yán)重危害草莓生產(chǎn)的真菌病害，炭疽病的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑。殺菌劑，尤其是甾醇C-14α-脫甲基酶抑制劑（DMIs）和線(xiàn)粒體呼吸抑制劑（QoI）廣泛應(yīng)用于草莓炭疽病和其它植物真菌病害的防治。本研究旨在以炭疽菌和DMIs為模型，更好地了解低劑量殺菌劑殘留對(duì)真菌產(chǎn)孢的作用，并希望在劑量和時(shí)間方面制定最*殺菌劑控制策略。作者對(duì)低劑量殺菌劑脅迫下的炭疽菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

1、炭疽菌菌株：從發(fā)病草莓和山藥組織中分離鑒定出108個(gè)炭疽菌菌株（Colletotrichum spp.），這些菌株分為5個(gè)種，其中89個(gè)C. siamense, 7 個(gè)C. fructicola, 5 個(gè)C. gloeosporioides,?4個(gè)C. aenigma和3個(gè)C. nymphaeae菌株。

2、殺菌劑：兩種DMI類(lèi)殺菌劑：苯醚甲環(huán)唑（95.0%）和咪鮮胺（97.0%），一種QoI類(lèi)殺菌劑：吡唑醚菌酯（98.3%）。

3、炭疽菌對(duì)殺菌劑脅迫的形態(tài)學(xué)響應(yīng)：觀察108個(gè)炭疽菌菌株在含有不同種類(lèi)和濃度殺菌劑的PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)的形態(tài)，記錄不同處理?xiàng)l件下各菌株的產(chǎn)孢情況。

4、從5種炭疽菌中選取20個(gè)代表性菌株評(píng)估殺菌劑脅迫對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響：包括 5個(gè)C. siamense, 4個(gè)C.?gloeosporioides, 4個(gè)C. fructicola, 4個(gè)C. aenigma和3個(gè)C. nymphaeae。

5、DMI對(duì)炭疽菌在植株組織上產(chǎn)孢的影響：用C. fructicola?菌株Gwha-1接種不同濃度苯醚甲環(huán)唑處理的草莓葉片，分析植物組織上分生孢子數(shù)量的變化趨勢(shì)。

6、轉(zhuǎn)錄組分析材料：用C. fructicola 菌株Gwha-1菌絲體做轉(zhuǎn)錄組，實(shí)驗(yàn)組：添加0.1593 μg/ml苯醚甲環(huán)唑的PDA培養(yǎng)基，對(duì)照組未添加任何殺菌劑，于28°C下黑暗條件下培養(yǎng)3天，每組取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣。

主要結(jié)果與分析

1、炭疽菌對(duì)殺菌劑脅迫的形態(tài)學(xué)響應(yīng)

對(duì)108個(gè)炭疽菌菌株的形態(tài)觀察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：在未添加任何殺菌劑PDA上于28°C黑暗中培養(yǎng)5天期間，除兩個(gè)C. nymphaeae菌株外，所有菌株的菌落顏色均未出現(xiàn)明顯變化。培養(yǎng)5天后，兩個(gè)C. nymphaeae菌株在PDA上產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的透明粉紅色菌落。苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺能夠促進(jìn)炭疽菌菌株的無(wú)性繁殖。隨著苯醚甲環(huán)唑或咪鮮胺濃度的增加，更多的菌株表現(xiàn)出菌落顏色的變化，表明產(chǎn)生了更多的分生孢子。在含有7.9667μg ml^-1苯醚甲環(huán)唑或0.8080μg ml^-1咪鮮胺的PDA上，分別有85和83株炭疽菌產(chǎn)生粉紅色菌落，表明分生孢子產(chǎn)量增加。然而，吡唑醚菌酯對(duì)炭疽菌在PDA上的產(chǎn)孢沒(méi)有顯著影響。說(shuō)明不同種類(lèi)殺菌劑對(duì)炭疽菌產(chǎn)孢的影響存在差異，DMI類(lèi)殺菌劑對(duì)炭疽菌產(chǎn)孢的促進(jìn)作用并不局限于某個(gè)種類(lèi)的炭疽菌或某幾個(gè)菌株，這種促進(jìn)作用在炭疽菌中廣泛存在。

2.苯醚甲環(huán)唑?qū)μ烤揖诓葺~片上產(chǎn)孢的影響

在接種后的前12天或16天C. fructicola在草莓葉片上的產(chǎn)孢量逐漸增加，然后下降。在接種初期（第4天和第8天），苯醚甲環(huán)唑抑制了C. fructicola的生長(zhǎng)，導(dǎo)致分生孢子產(chǎn)量低于未經(jīng)處理的對(duì)照。在接種后4天和8天時(shí)，7.9667 μg ml^-1苯醚甲環(huán)唑處理的分生孢子產(chǎn)量顯著低于對(duì)照。苯醚甲環(huán)唑濃度為0.0319 μg ml^-1、8 dai時(shí)的分生孢子產(chǎn)量也顯著低于對(duì)照組。然而，在接種后12天和16天時(shí)，苯醚甲環(huán)唑處理的葉片上的分生孢子產(chǎn)量顯著高于未處理的對(duì)照?？偟膩?lái)說(shuō)，苯醚甲環(huán)唑處理過(guò)的葉片在0.0319 lg ml^-1和7.9667 μg ml^-1下的最高分生孢子產(chǎn)量分別是未處理對(duì)照最高分生孢子產(chǎn)量的1.29倍和1.46倍。說(shuō)明DMI能夠促進(jìn)炭疽菌在植物組織上的產(chǎn)孢量增加，具有影響病害田間病害流行的風(fēng)險(xiǎn)。

3、麥角甾醇生物合成途徑相關(guān)的差異基因分析

在真菌中，麥角甾醇是由乙酰輔酶A（乙酰輔酶A）通過(guò)復(fù)雜途徑合成的。釀酒酵母中的麥角甾醇生物合成步驟研究較為透徹，共有21個(gè)基因參與麥角甾醇生物合成。我們從C. fructicola中找到了相關(guān)同源基因。在苯醚甲環(huán)唑脅迫下，在參與麥角甾醇生物合成的基因中，與對(duì)照相比， Erg11（DMI殺菌劑的靶標(biāo)，在真菌中被稱(chēng)為CYP51）基因被發(fā)現(xiàn)上調(diào)。Erg6、Erg27、Erg3和Erg5基因表達(dá)量也上調(diào)。與對(duì)照組相比，Erg4基因受到抑制。苯醚甲環(huán)唑處理后，其他15個(gè)基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。說(shuō)明：DMI類(lèi)殺菌劑對(duì)炭疽菌產(chǎn)孢的促進(jìn)作用可能與麥角甾醇合成途徑中基因表達(dá)量的變化及甾醇種類(lèi)變化有關(guān)。

4.與產(chǎn)孢調(diào)控有關(guān)的差異基因分析

通過(guò)局部BLAST搜索，找到了幾乎所有已知與分生孢子形成有關(guān)的31個(gè)同源基因。在這些基因中，AbaA和WetA是真菌產(chǎn)孢的中央調(diào)節(jié)因子，幾乎所有環(huán)境因子對(duì)產(chǎn)孢的調(diào)控均需通過(guò)中央調(diào)節(jié)因子。在苯醚甲環(huán)唑脅迫下，中央調(diào)節(jié)因子AbaA和WetA基因的表達(dá)顯著增加，該結(jié)果從基因表達(dá)層面進(jìn)一步驗(yàn)證了DMI對(duì)炭疽菌產(chǎn)孢的促進(jìn)作用。NsdC、NsdD、PpoA、PpoB、OsaA和PpoC在發(fā)育平衡中發(fā)揮作用，苯醚甲環(huán)唑脅迫下PpoC的表達(dá)顯著增加。FluG、SfgA、FlbA、FlbB、FlbC、FlbE和FlbD參與FluG介導(dǎo)的信號(hào)通路，苯醚甲環(huán)唑脅迫下，F(xiàn)lbA和FlbD的表達(dá)水平顯著升高，而SfgA的表達(dá)水平顯著降低。其他14個(gè)基因在光依賴(lài)性信號(hào)通路（LreA、LreB和FphA）、MAP激酶信號(hào)通路（MpkB、MkkB、SteC和SteD）、G蛋白信號(hào)通路（FadA和PkaA）、轉(zhuǎn)錄因子（SltA、AreA、ZipA、MtfA和RlmA）和Velvet家族蛋白（VelB和VosA）中發(fā)揮作用，這些基因的表達(dá)量在苯醚甲環(huán)唑脅迫下沒(méi)有顯著改變。該研究結(jié)果表明：環(huán)境DMI殺菌劑脅迫信號(hào)可能通過(guò)FluG信號(hào)通路傳導(dǎo)至中央調(diào)節(jié)因子。

總結(jié)

在PDA培養(yǎng)基和植物組織上，低濃度的DMI殺菌劑能促進(jìn)炭疽菌的產(chǎn)孢，而線(xiàn)粒體呼吸抑制劑（QoIs）對(duì)炭疽菌的產(chǎn)孢沒(méi)有顯著影響。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，DMI殺菌劑信號(hào)可能通過(guò)FluG介導(dǎo)的信號(hào)通路傳遞到中央調(diào)控通路，進(jìn)一步證實(shí)了DMI殺菌劑促進(jìn)炭疽菌產(chǎn)孢的形態(tài)學(xué)效應(yīng)。

研究結(jié)果表明，殺菌劑對(duì)病原真菌的生長(zhǎng)和繁殖具有雙向作用，本研究為科學(xué)合理地使用殺菌劑提供了新的依據(jù)。