蛋白質(zhì)組學(xué)在植物研究中的應(yīng)用

當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)已成為21世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)等研究領(lǐng)域最活躍的熱點(diǎn)之一，其理論和方法在植物學(xué)科中的應(yīng)用方興未艾，已滲透到植物遺傳學(xué)、植物生理學(xué)、植物發(fā)育生物學(xué)、植物生態(tài)學(xué)、植物共生生物學(xué)和植物病理學(xué)等諸多領(lǐng)域，為農(nóng)學(xué)、林學(xué)、畜牧學(xué)和水產(chǎn)學(xué)等相關(guān)農(nóng)業(yè)生物科學(xué)領(lǐng)域的研究注入了新的活力。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在作物遺傳育種，作物逆境脅迫應(yīng)答，作物品質(zhì)改良和農(nóng)作物-微生物相互作用等領(lǐng)域的研究中得到了廣泛應(yīng)用。

蛋白質(zhì)組學(xué)在植物研究中的應(yīng)用案例一

中文標(biāo)題：比較非標(biāo)記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了N-連接糖鏈通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白豐度對(duì)擬南芥耐鹽性起到的關(guān)鍵作用

研究對(duì)象：擬南芥幼苗

發(fā)表期刊：Frontiers?in?Plant?Science

運(yùn)用技術(shù)：非標(biāo)記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)

研究背景

作為固著生物，陸地植物經(jīng)常遭受各種壓力和不利環(huán)境，例如極端溫度、干旱和高鹽度。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，高鹽分影響自然界作物的地理分布，造成大量的產(chǎn)量損失。許多研究表明，多種基因和/或代謝途徑在植物的非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同作用，很難通過(guò)調(diào)節(jié)單一有效基因或蛋白質(zhì)來(lái)顯著提高植物對(duì)外界脅迫的抵抗力。

在植物中，N-糖基化參與許多生物過(guò)程，包括類固醇激素受體的?ER?質(zhì)量控制、配子體識(shí)別,?亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn),?植物先天免疫?和氣孔發(fā)育等，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)底物蛋白的穩(wěn)定性、功能或亞定位實(shí)現(xiàn)調(diào)控過(guò)程。此外研究發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的N-聚糖生物合成失敗會(huì)導(dǎo)致擬南芥幼苗對(duì)鹽敏感，但對(duì)其潛在的分子機(jī)制仍知之甚少。本文利用納升流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜?(nanoLC-MS/MS)?技術(shù)進(jìn)行了無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析，比較分析了野生型?(WT)?和兩個(gè)抗鹽脅迫的突變體的蛋白質(zhì)組差異。

研究流程

研究結(jié)果

從632個(gè)多肽中共鑒定出727個(gè)糖基化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于371個(gè)糖蛋白。大多數(shù)?N-糖基化位點(diǎn)表現(xiàn)出典型的NXS/T基序序列。鑒定出的?N-糖蛋白的數(shù)量因樣品而異。在對(duì)照組中，在mns1?mns2中鑒定出311個(gè)糖蛋白，在cgl1-3突變體中鑒定出300個(gè)糖蛋白，而在WT中僅鑒定出203個(gè)。在WT中，減少的N-糖蛋白可能是因?yàn)閿y帶復(fù)雜N-聚糖的糖蛋白的富集程度低于突變體中具有高甘露糖型?N-聚糖的糖蛋白。然而，在高鹽度存在的情況下，WT中檢測(cè)到的糖蛋白數(shù)量略有增加（從203到244），但在mns1mns2（從311到297）和cgl1-3（從300到263；圖1）中出現(xiàn)減少。一種可能性是響應(yīng)鹽脅迫的糖蛋白的豐度受到附著的N-聚糖的調(diào)節(jié)，N-聚糖的欠成熟使鹽脅迫條件下相關(guān)的糖蛋白不穩(wěn)定，這與之前的研究一致，即N-聚糖的成熟對(duì)植物耐受鹽脅迫至關(guān)重要。

文中進(jìn)一步分析了鹽脅迫下DAG在GO注釋和KEGG代謝途徑中的生物學(xué)功能。在兩個(gè)突變體中觀察到更多減少的糖蛋白，尤其是在cgl1-3中（圖2?A–C）。值得注意的是，與?WT?相比，?mns1?mns2和cgl1-3突變體中的水解酶均得到富集（圖2?D–F）。在鹽脅迫下，WT和兩個(gè)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚糖鏈轉(zhuǎn)移的突變體中?STT3A（OST亞基）、紫色酸性磷酸酶?2（PAP2）和類胚蛋白10（GLP10）的豐度發(fā)生了變化，這些蛋白分別參與了根系生長(zhǎng)和碳代謝（圖2?D）。STT3A在?WT中增加，但在mns1?mns2和cgl1-3中減少；PAP2?在?WT?和mns1mns2中增加，但在cgl1-3中減少，并且GLP10在所有三個(gè)樣本中都增加。進(jìn)一步的分子功能分析發(fā)現(xiàn)，與WT相比，水解酶活性在mns1?mns2和cgl1-3中富集（圖2?E,G）。WT中鑒定的蛋白質(zhì)的生物學(xué)過(guò)程多與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，而來(lái)自突變體的大多數(shù)DAG與碳水化合物代謝過(guò)程有關(guān)（圖3?G）。這些結(jié)果表明，mns1?mns2和cgl1-3突變體中的鹽響應(yīng)糖蛋白不能正確響應(yīng)壓力，這可能是由于缺乏正確的N-聚糖修飾，導(dǎo)致它們的亞細(xì)胞定位異常。

研究結(jié)論

許多證據(jù)表明，植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)需要相關(guān)蛋白上加工成熟的N-聚糖參與。然而，關(guān)于在這個(gè)過(guò)程中起作用的鹽響應(yīng)糖蛋白知之甚少。本研究鑒定了野生型?(WT)擬南芥中的鹽響應(yīng)糖蛋白和兩個(gè)N-聚糖成熟缺陷的突變體mns1?mns2和cgl1。通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜?(LC-MS/MS)?進(jìn)行定量分析，共鑒定出97種豐度變化?>?1.5?的蛋白質(zhì)對(duì)抗鹽脅迫。表明N-聚糖對(duì)于調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)蛋白水平至關(guān)重要，并且列出了幾種負(fù)責(zé)擬南芥耐鹽脅迫的新型糖蛋白。

蛋白質(zhì)組學(xué)在植物研究中的應(yīng)用案例二

中文標(biāo)題：通過(guò)非標(biāo)記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示菊芋（Helianthus?tuberosus?L.）塊莖蛋白質(zhì)組

研究對(duì)象：菊芋塊莖

期刊：Molecules

運(yùn)用技術(shù)：非標(biāo)記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究背景Helianthus?tuberosus?L.，俗稱菊芋（簡(jiǎn)稱JA），是向日葵科菊科（菊科）的一年生草本植物。這種植物以其對(duì)環(huán)境壓力的抵抗力而聞名，并且在不同的土壤（干旱-鹽堿）和溫度（冷-熱）條件下茁壯成長(zhǎng)，這使它在世界大部分地區(qū)都有種植。除此之外，該植物還因其在原料、功能性食品、生物質(zhì)、生物醫(yī)學(xué)和化學(xué)工業(yè)中的重要性而聞名。該研究小組一直致力于將菊芋塊莖作為日常生活中的傳統(tǒng)/替代藥物進(jìn)行栽培和利用，并研究降低人體受試者的血糖水平、HbA1c等。了解塊莖的蛋白質(zhì)成分可能會(huì)揭示其愈合特性，尤其是與糖尿病有關(guān)的特性。本文使用三種商業(yè)加工的JA塊莖產(chǎn)品（干粉和干片）進(jìn)行了非標(biāo)記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

研究技術(shù)流程

研究結(jié)果

無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法用于分析三個(gè)塊莖樣品之間的差異蛋白質(zhì)豐度。去除污染物和低置信度蛋白后，共鑒定出2967個(gè)高置信度蛋白組（圖1?A）。由于使用了三種不同的塊莖樣品，在MS運(yùn)行后預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)多個(gè)缺失值；因此，在三個(gè)重復(fù)中的兩個(gè)（2102個(gè)蛋白質(zhì)組）中可重復(fù)鑒定的蛋白質(zhì)組被選擇并考慮進(jìn)行進(jìn)一步分析（圖1?A）。

維恩圖分析顯示1702個(gè)蛋白質(zhì)組通常在所有三個(gè)塊莖樣品中鑒定，而89、36和54個(gè)蛋白質(zhì)組分別僅在塊莖?1、2和3中鑒定。此外，塊莖?1?和塊莖?2?共有?112?個(gè)蛋白質(zhì)組，表明它們的蛋白質(zhì)組與塊莖對(duì)?(2,3)?和?(3,1)?相比更密切相關(guān)（圖1?B）。為了檢查同一樣品一式三份中無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)定量的重現(xiàn)性，使用?Perseus軟件生成多散點(diǎn)圖（圖1?C）。相同樣本的散點(diǎn)圖顯示出典型的非均勻分布，即在較低強(qiáng)度時(shí)較寬，在較高強(qiáng)度時(shí)指向較高。同一樣品的不同重復(fù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)大于0.944，表明同一樣品的三次重復(fù)之間具有高度相關(guān)性。直方圖顯示了缺失值插補(bǔ)前后的蛋白質(zhì)計(jì)數(shù)?(圖1?D)。

層次聚類分析將差異蛋白分成四個(gè)簇，每個(gè)簇都有不同的表達(dá)譜（圖2?A）。簇1包含61種蛋白質(zhì)，在塊莖3中主要下調(diào)，而簇1的891種蛋白質(zhì)主要在塊莖2中上調(diào)。簇3顯示塊莖3中豐度增加的379種蛋白質(zhì)，而簇4中的771種蛋白質(zhì)在塊莖?1?中顯示最大豐度。顯示前48種差異調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)豐度模式的熱圖位于?(圖2?B）。在這48個(gè)DEs中鑒定了多種具有獨(dú)特功能的蛋白質(zhì)。共有19、24和34種DE蛋白受到高度調(diào)節(jié)，而塊莖1-3中分別有27、22和14種蛋白質(zhì)降低。結(jié)果表明，塊莖?1?和塊?3?的蛋白質(zhì)含量非常不同，而塊莖2的結(jié)果則參差不齊。此外，偏最小二乘判別分析?(PLS-DA)?將成分?1?中的塊莖1和3分開(kāi)，占總方差的32.7%，而成分2中的塊莖2與塊莖1和3分開(kāi)，占總方差的?25.5%總方差的百分比?(圖2?C）。最后確定了有助于PLS-DA圖分離的前15種蛋白質(zhì)（圖2?D)。

統(tǒng)計(jì)分析后，作者進(jìn)行基于基因本體（GO）的功能分類，在2102種蛋白質(zhì)中，PANTHER?19.0?針對(duì)Helianthus?annus數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)到2044種蛋白質(zhì)。接下來(lái)，進(jìn)行?PANTHER?通路分析以對(duì)蛋白質(zhì)通路進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)蛋白質(zhì)歸因于泛素蛋白體和核苷酸（嘌呤）生物合成途徑，其次是TCA循環(huán)、糖酵解、丙酮酸代謝、細(xì)胞周期和嘧啶核糖核苷酸途徑。

本文還確定了幾種直接或間接參與各種疾病相關(guān)機(jī)制的蛋白質(zhì)。三種蛋白質(zhì)命中被確定與阿爾茨海默病相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)?11?個(gè)蛋白質(zhì)屬于亨廷頓病通路。除此以外，作者還確定了眾所周知的具有治療意義的蛋白質(zhì)，當(dāng)作為膳食蛋白質(zhì)來(lái)源或通過(guò)口服補(bǔ)充劑食用時(shí)，這些主要用于治療糖尿病和癌癥等慢性疾病。還鑒定了一些抗微生物蛋白（圖3）。

研究結(jié)論

本文使用基于高通量無(wú)標(biāo)記LC-MS/MS的組學(xué)技術(shù)對(duì)來(lái)自兩種不同菊芋加工技術(shù)，包括干粉（塊莖?1?和?2）和干片（塊莖?3）的塊莖蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。鑒定出的蛋白質(zhì)及其分類表明了支持了先前的研究數(shù)據(jù)（尚未發(fā)表）的功能：數(shù)據(jù)表明菊芋對(duì)血糖水平有降低作用，以及與人類糖化血紅蛋白?(Hb-A1c)?的關(guān)系，預(yù)防老年癡呆以及治療亨廷頓病等功效。