目前研究表明，5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和 5-羥甲基胞嘧啶 (5hmC) 是哺乳動(dòng)物基因組中常見的兩種表觀遺傳標(biāo)記。此外，當(dāng)5mC在基因啟動(dòng)子中水平升高時(shí)，5mC會(huì)抑制基因轉(zhuǎn)錄。5hmC可能是5mC氧化產(chǎn)物的中間體，并且還穩(wěn)定地參與到基因組DNA中，具有很高的穩(wěn)定性。在啟動(dòng)子區(qū)域用 5hmC 替換 5mC 可以重新激活基因轉(zhuǎn)錄。因此，區(qū)分甲基化和羥甲基化啟動(dòng)子至關(guān)重要。目前用于分析DNA甲基化的“金標(biāo)準(zhǔn)”是亞硫酸氫鹽測序，統(tǒng)計(jì)分析的是甲基化 (5mC) 和羥甲基化 (5hmC) 的總和 。而納米孔測序技術(shù)（nanopore，ONT）可以直接從天然的DNA鏈中檢測5mC，精準(zhǔn)分析甲基化水平。百邁客是中國大陸目前通過 PromthION/GridION平臺及DNA/RNA樣本官方認(rèn)證的公司。截至目前為止，百邁客ONT平臺已經(jīng)建立超過上百種物種類型的文庫，擁有大量的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)！無論是技術(shù)還是項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)上，我們都實(shí)力過硬！
摘要
多個(gè)腫瘤抑制基因（TSG）的下調(diào)在癌癥形成中起重要作用。最近的證據(jù)表明，癌癥進(jìn)展涉及表觀遺傳修飾的全基因組改變，這可能導(dǎo)致腫瘤抑制基因的下調(diào)。針對肝細(xì)胞癌 (HCC) 細(xì)胞，利用納米孔測序技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)繪制5-甲基胞嘧啶信號以識別新的TSG。甲基化數(shù)據(jù)與再生肝臟和原發(fā)性HCC的轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)的整合分析共鑒定到13個(gè)潛在的腫瘤抑制基因候選者。隨后專注于對一種候選物——葡萄糖激酶 (GCK) 進(jìn)行功能表征的驗(yàn)證。結(jié)果表明，GCK的過表達(dá)通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)乳酸積累來抑制HCC細(xì)胞的增殖，也由于NAD+耗竭而導(dǎo)致能量危機(jī)。這表明GCK作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用，可能參與HCC的發(fā)展。
背景介紹
肝細(xì)胞癌 (HCC) 是全球常見的腫瘤類型之一；然而，目前的治療選擇有限，沒有有效的醫(yī)療策略。HCC通常發(fā)生在慢性肝病的背景下，其風(fēng)險(xiǎn)因素包括病毒性或自身免疫性肝炎、慢性酒精濫用和非酒精性脂肪肝。這些風(fēng)險(xiǎn)因素會(huì)引發(fā)異常的肝臟再生，從而引發(fā)HCC的形成。然而，潛在的分子機(jī)制仍然很大程度上未知。
據(jù)報(bào)道，失調(diào)的DNA甲基化是HCC發(fā)病機(jī)制中的早期事件之一。此外，近期有研究數(shù)據(jù)表明多個(gè)腫瘤抑制基因如CDKN2A、HNF4A和TTP，通過啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生在HCC細(xì)胞和再生的肝細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用的，提示啟動(dòng)子甲基化讓TSG表達(dá)失調(diào)可能是HCC形成的一個(gè)重要因素。因此，新型TSG的鑒定將為闡述HCC形成的分子機(jī)制提供線索。
材料方法
實(shí)驗(yàn)材料：HepG2、Huh7、C3A 和 HLF 細(xì)胞（肝癌細(xì)胞系)
實(shí)驗(yàn)技術(shù)：ONT甲基化測序，EPIC測序，免疫組織化學(xué) (IHC)，免疫印跡雜交，RT-PCR，葡萄糖-6-磷酸(Glucose 6-P)測定，乳酸測定，NAD+/NADH測定，ATP 測定，結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)
結(jié)果
一、HCC細(xì)胞中高甲基化基因的鑒定
利用ONT平臺對HCC細(xì)胞系 (HepG2) 進(jìn)行測序，并和HepG2細(xì)胞的全基因組亞硫酸氫鹽測序 (WGBS) 數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，如圖1A所示，ONT測序的甲基化信號與 WGBS的甲基化信號具有良好的相關(guān)性。ONT測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)甲基化水平在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) (TSS) 下降（圖1B），ONT測序數(shù)據(jù)和WGBS數(shù)據(jù)分別檢測到3332和5099個(gè)基因的3711和7013個(gè)高甲基化啟動(dòng)子（圖1C）。發(fā)現(xiàn)通過ONT測序檢測到的87%的高甲基化基因（2904個(gè)基因）也同時(shí)被WGBS檢測到（圖1D)。接下來分析了只有WGBS數(shù)據(jù)檢測到的2195個(gè)高甲基化基因的ONT測序覆蓋率，以識別可能的羥甲基化基因，發(fā)現(xiàn)有489個(gè)至少有5條ONT測序的reads覆蓋，但是軟件并沒有檢測到有5mc甲基化水平（圖1E），提示這些可能是羥甲基化。這些數(shù)據(jù)表明利用ONT測序數(shù)據(jù)分析5mC，能夠?qū)?mC 與胞嘧啶的其他修飾區(qū)分開。為了進(jìn)一步提取高度可信的甲基化信號，針對約3000萬個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行了EPIC測序，在ONT測序數(shù)據(jù)和WGBS數(shù)據(jù)中檢測到的2904個(gè)高甲基化基因，有1637個(gè)可以通過EPIC測序驗(yàn)證（圖1G）。
圖1 肝細(xì)胞癌中高5mC甲基化的基因鑒定
二、HCC中識別新型TSG候選者
在肝再生過程中，增殖基因被激活，而抗增殖基因被抑制，從而使靜止的肝細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。本研究選取小鼠三分之二肝部分切除術(shù) (PH) 之前和之后四小時(shí)檢測高甲基化基因的表達(dá)水平，挑選標(biāo)準(zhǔn)是與對照假手術(shù)（SH）相比表達(dá)量下調(diào)超過兩倍的基因，以及這些基因應(yīng)該在部分肝切除術(shù)后一周內(nèi)恢復(fù)表達(dá)量（圖2A）?；谶@些標(biāo)準(zhǔn)，選取了56個(gè)基因。之后在TCGA的 371 個(gè)人類原發(fā)性 HCC和50個(gè)正常肝臟的RNA-seq數(shù)據(jù)中比較這些基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)13 個(gè)在 HCC 中下調(diào)超過兩倍（圖2BC），其中有3個(gè)基因已知是腫瘤抑制基因（圖 2C) ，分別是粘附連接相關(guān)蛋白 1 (AJAP1)、GATA 結(jié)合蛋白 5 (GATA5) 和卵磷脂視黃醇?；D(zhuǎn)移酶 (LRAT) 。此外，其余10個(gè)潛在的抑癌基因具有不同的功能，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控 (NFATC2)、細(xì)胞遷移 (EFS和CXCL12)、葡萄糖代謝 (GCK) 和細(xì)胞生長 (PTH1R 和 SH3YL1)。
圖2 候鑒定選腫瘤抑制基因
三、葡萄糖激酶 (GCK)的異位表達(dá)抑制HCC細(xì)胞的增殖
由于葡萄糖代謝的重編程是 HCC 的標(biāo)志之一，進(jìn)一步關(guān)注表征一種TSG 候選物 – 葡萄糖激酶 (GCK) 的抗增殖作用。為了檢驗(yàn)GCK是否可能在HCC 細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用，首先分析了GCK在正常人肝臟和四種HCC細(xì)胞系中的表達(dá)，即Huh7、HepG2、C3A 細(xì)胞和 HLF 細(xì)胞（圖3A）。發(fā)現(xiàn)GCK在正常肝臟中高表達(dá)，在Huh7、HepG2、C3A細(xì)胞和HLF細(xì)胞中未檢測到有表達(dá)。然后在這些細(xì)胞系中過表達(dá)帶有FLAG 標(biāo)記的GCK（圖3B) ，并使用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢查細(xì)胞生長。GCK 的過表達(dá)強(qiáng)烈抑制 HepG2 和 C3A 細(xì)胞的生長，而在 HLF 和 Huh7 細(xì)胞中生長抑制的效果不太明顯，但仍很顯著（圖3C）。利用增殖標(biāo)記物Ki67進(jìn)行的免疫組化染色證實(shí)了過表達(dá)GCK的HepG2和C3A細(xì)胞生長受到抑制（圖3D)。為了檢查GCK過表達(dá)后HepG2和C3A細(xì)胞的減少，是否是因?yàn)樵鲋呈艿揭种坪褪艿降蛲稣T導(dǎo)，對凋亡標(biāo)記物PARP進(jìn)行了免疫印跡雜交實(shí)驗(yàn)。如圖3E所示，在GCK過表達(dá)的細(xì)胞中PARP沒有增加。這些數(shù)據(jù)表明GCK的過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖但不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
圖3 GCK的過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖
四、葡萄糖激酶的異位表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸積累
研究表明在高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的大鼠肝癌細(xì)胞中，葡萄糖激酶的過表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)葡萄糖攝取和高水平的乳酸積累。值得注意的是，本研究的細(xì)胞也是在高葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。因此，檢測了對照和GCK過表達(dá)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)葡萄糖6-磷酸（葡萄糖 6-P）和乳酸的含量。盡管在HepG2和Huh7細(xì)胞中GCK過表達(dá)后 Glucose 6-P水平都是增加的（圖4A），但是細(xì)胞內(nèi)乳酸僅在HepG2細(xì)胞中顯著積累（圖4B）。丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸脫氫酶的過程在NAD+的再生中起關(guān)鍵作用，在高濃度的乳酸下，乳酸脫氫酶表現(xiàn)出反饋抑制，NAD+再生率降低。NAD+在糖酵解過程中被還原為NADH，需要持續(xù)供應(yīng)NAD+以維持連續(xù)的高糖酵解速率和最*細(xì)胞生長速率。NAD+/NADH比率的下降與細(xì)胞增殖的減少相關(guān)。因此，接下來檢測了細(xì)胞內(nèi)乳酸積累對NAD+再生和ATP產(chǎn)生的影響。如圖4C所示，在GCK過表達(dá)的細(xì)胞中NAD+/NADH比率顯著下降，并伴隨著ATP水平的降低（圖4D)，提示NAD+消耗導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)乳酸積累而引起能量危機(jī)。
圖4 GCK過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸積累并引起能量危機(jī)
五、MCT2 是減少 GCK 過表達(dá)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)乳酸積累所必需的
由于GCK過表達(dá)并未強(qiáng)烈誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞中的乳酸積累，這就提出了乳酸是如何在這些細(xì)胞中外排的問題。乳酸外排由雙向單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCTs)介導(dǎo)，已知有四種MCT可轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸，因此檢測了在 Huh7 和 HepG2 細(xì)胞中MCT變異體的表達(dá)。有趣的是，HepG2細(xì)胞僅表達(dá)MCT1和MCT4，而Huh7 細(xì)胞表達(dá)了三種變異體（圖4E)。還通過免疫印跡雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HepG2 細(xì)胞中缺乏 MCT2的表達(dá)（圖4F）。這些數(shù)據(jù)提出了隨后的問題，即細(xì)胞內(nèi)乳酸積累是否由于HepG2細(xì)胞中缺乏MCT2所致。為了檢驗(yàn)這種可能性，耗盡了GCK過表達(dá)的Huh7細(xì)胞中的MCT2（圖4G) 并檢測了細(xì)胞內(nèi)乳酸的濃度。事實(shí)上，MCT2 的消耗顯著誘導(dǎo)了乳酸的積累（圖4H）。因此，在MCT2耗盡的細(xì)胞中，NAD+/NADH 比率顯著下降（圖4I) 并伴隨細(xì)胞增殖的減少(圖4J)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明MCT2的缺乏在GCK過表達(dá)的細(xì)胞中顯著積累了乳酸。
討論
參考文章：
Davenport CF, Scheithauer T, Dunst A, et al. Genome-Wide Methylation Mapping Using Nanopore Sequencing Technology Identifies Novel Tumor Suppressor Genes in Hepatocellular Carcinoma. Int J Mol Sci. 2021;22(8):3937. Published 2021 Apr 11. doi:10.3390/ijms22083937
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