基因組作為生命信息的承載體，蘊(yùn)含著每種生物的全部遺傳信息。近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，基因組學(xué)研究已經(jīng)逐漸成為一項(xiàng)非常重要的基礎(chǔ)研究，而自然界中每個(gè)物種的基因組都有望被成功破譯。為了能讓更多想要進(jìn)行基因組項(xiàng)目的科研工作者都能有個(gè)初步了解，今天小編整理了一些常見問題，一起來看看吧！
Question01：為什么要構(gòu)建基因組？
Answer：基因組表示的是一個(gè)物種內(nèi)全部的遺傳信息，沒有參考基因組使得關(guān)鍵基因無法被挖掘，調(diào)控機(jī)理難以被解析，成為科研的掣肘。而早期構(gòu)建的參考基因組質(zhì)量往往較差，導(dǎo)致①組裝不完整，可能遺失相當(dāng)多的基因片段，想要的基因因?yàn)槲幢唤M裝到而被錯(cuò)失。②連續(xù)性較差，短片段較多，且不利于研究由較長(zhǎng)片段形成的與功能相關(guān)的基因。③拼接準(zhǔn)確性有偏差，較短的片段在拼接時(shí)易因序列重復(fù)導(dǎo)致排序錯(cuò)誤，從而影響后續(xù)相關(guān)研究的順利進(jìn)行。甚者，所研究品種與已發(fā)表參考不同使得研究受到阻礙①相同的種下不同的品種/品系/變種比對(duì)率低，可用數(shù)據(jù)少；②雌雄性別差異，公布只有單個(gè)性別，找不到性別相關(guān)區(qū)域。
Question02：基因組的組裝難易程度主要由哪些方面影響？
Answer：①基因組大小?；蚪M越大，對(duì)應(yīng)的重復(fù)序列往往越豐富，導(dǎo)致拼接的難度越高；②雜合度與重復(fù)序列比例。相同大小的基因組下，雜合度和重復(fù)比例越高，基因組組裝的連續(xù)性和完整性會(huì)越低（高雜合的基因組往往無法合并姊妹染色體，導(dǎo)致組裝的結(jié)果偏大，雜合位點(diǎn)容易拼接斷裂使得連續(xù)性降低，而重復(fù)序列在組裝中會(huì)被折疊，使組裝中出現(xiàn)缺口、錯(cuò)誤，導(dǎo)致組裝的結(jié)果偏?。?。因此通常會(huì)需要適當(dāng)增加測(cè)序深度以覆蓋這些復(fù)雜的區(qū)域。③基因組的倍性和倍型。難易程度由易至難分別為：二倍體＞異源多倍體＞同源多倍體。
Question03：如何知道物種基因組大?。?/p>
Answer：①已發(fā)表過基因組的可通過NCBI網(wǎng)站查詢：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/②未發(fā)表基因組的通過流式網(wǎng)站查詢：植物–https://cvalues.science.kew.org/?；動(dòng)物：http://www.genomesize.com/③進(jìn)行流式、survey（調(diào)研圖）進(jìn)行分析
Question04：Survey是什么？可否不進(jìn)行？
Answer：①Survey以二代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，基于小片段文庫進(jìn)行低深度測(cè)序，通過K-mer分析，快速獲得基因組大小、雜合度、重復(fù)序列比例等基本信息的研究方法。為制定該物種的全基因組de novo測(cè)序策略提供有效依據(jù)。②survey的二代數(shù)據(jù)具有糾錯(cuò)和評(píng)估的重要作用，除非是已知基因組大小的單倍體等背景較為清晰的物種情況下，通過HiFi模式組裝，并且不需要做二代數(shù)據(jù)評(píng)估，可以考慮不進(jìn)行，否則建議為必須進(jìn)行。
Question05：為什么三代測(cè)序樣品要與二代survey測(cè)序樣品來自同一個(gè)個(gè)體？
Answer：①不同個(gè)體間會(huì)存在一定差異，若選材差異大可能會(huì)影響到三代測(cè)序策略的制定②二代數(shù)據(jù)需為Nanopore/Pacbio CLR模式基因組進(jìn)行糾錯(cuò)，避免因個(gè)體間序列差異影響糾錯(cuò)效果③二代數(shù)據(jù)需回比組裝完成的基因組來評(píng)估該基因組組裝的完整性，避免因個(gè)體間序列差異降低比對(duì)率。
Question06：是否必須等Survey分析完之后才能啟動(dòng)三代測(cè)序？
Answer：針對(duì)已知倍型倍性、已明確基因組大?。ㄍㄟ^流式等方式）或已經(jīng)發(fā)表過同品種、近緣種材料的項(xiàng)目，可以同時(shí)啟動(dòng)survey與三代測(cè)序，節(jié)約時(shí)間成本，使項(xiàng)目更快的推進(jìn)。
若物種背景尚不完全明晰，需要先完成survey，再開展三代測(cè)序組裝。基于該物種基因組的大小、雜合及重復(fù)序列比例來制定合適的三代測(cè)序深度與數(shù)據(jù)量。
Question07：什么是HiFi測(cè)序？跟以前傳統(tǒng)的測(cè)序模式有什么區(qū)別？
Answer：目前PacBio Sequel II平臺(tái)可提供CLR library和HiFi library兩種模式，CLR文庫是傳統(tǒng)的組裝時(shí)構(gòu)建的文庫類型，采用20 Kb、30 Kb等長(zhǎng)片段類型的DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建，獲得Subreads，單堿基準(zhǔn)確率在85%左右，因此在基因組組裝前，需要通過canu等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)糾錯(cuò)后用于下一級(jí)應(yīng)用。HiFi reads（High fidelity reads）是兼顧長(zhǎng)讀長(zhǎng)和高準(zhǔn)確度的測(cè)序序列，即15Kb-20Kb片段文庫，進(jìn)行單一片段多輪測(cè)序的方式來提升準(zhǔn)確性，單堿基準(zhǔn)確率可達(dá)99%。HiFi測(cè)序結(jié)合Hifiasm及HiCanu等軟件，可在較少的資源消耗下快速完成基因組的組裝，并保證結(jié)果的高準(zhǔn)確性和連續(xù)性，尤其是對(duì)超大、超高雜合等復(fù)雜基因組具有明顯優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也為高精度基因組注釋、變異檢測(cè)等應(yīng)用提供了更有利的支持。
Question08：為什么PacBio HiFi測(cè)序只用幾十乘深度即可滿足分析需求
Question09：什么是染色體版本基因組？如何構(gòu)建染色體水平的基因組？
Answer：染色體版基因組是指：將三代測(cè)序等方式拼接到的基因組序列分配至染色體組中，明確位置與方向向，使組裝的基因組達(dá)到染色體水平。常用的方式主要為Hi-C、遺傳圖譜或光學(xué)圖譜。
Question10：為何使用Hi-C進(jìn)行染色體的掛載？其原理是什么
Answer：Hi-C技術(shù)將線性距離遠(yuǎn)、空間結(jié)構(gòu)近的DNA片段進(jìn)行交聯(lián)富集后Pair-end測(cè)序，根據(jù)同一條染色體上的染色質(zhì)片段互作頻率更高，不同染色體間的互作頻率較低的特點(diǎn)，推導(dǎo)出基因組的三維空間結(jié)構(gòu)和基因之間可能的調(diào)控關(guān)系。利用Hi-C測(cè)序數(shù)據(jù)將Draft genome序列進(jìn)行染色體群組的劃分，并確定各序列在染色體上的順序和方向，使基因組組裝組裝水平提升到染色體水平。
與其他技術(shù)相比，Hi-C具有以下優(yōu)點(diǎn)，因此具有更廣闊的發(fā)展①無需群體，單個(gè)個(gè)體就能實(shí)現(xiàn)染色體掛載；②標(biāo)記密度更大，錨定染色體效率高，掛載率≥90%；③可以對(duì)已組裝的基因組進(jìn)行糾錯(cuò)；④分析周期短，準(zhǔn)確性高
Question11：哪些參數(shù)可以評(píng)估構(gòu)建的基因組？
Answer：①基因組大小及連續(xù)性（N50）：基因組組裝大小與調(diào)研圖一致、N50值越高越好。（通常contigN50值≥1Mb即可滿足絕大多數(shù)分析需求）②二代回比率：將二代高通量測(cè)序得到的短序列與組裝得到的基因組比對(duì)，通過統(tǒng)計(jì)比對(duì)率，可評(píng)估組裝基因組的完整性。③Busco/Cegma等數(shù)據(jù)庫評(píng)估：在組裝得到的基因組上查找軟件數(shù)據(jù)庫中的保守基因，通過找到的保守基因比例，評(píng)估基因組上基因組裝的完整性。④LAI評(píng)估，鑒定完整LTR-RTs占比。
Question12：為什么做基因組需要測(cè)RNA？還需要提供混組織的樣品？
Answer：在基因組組裝完之后需要對(duì)基因組的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行預(yù)測(cè)與注釋。目前基因預(yù)測(cè)是從頭預(yù)測(cè)（基于結(jié)構(gòu)）、同源預(yù)測(cè)（基于近緣物種）、轉(zhuǎn)錄組（基于表達(dá)基因）三部分結(jié)合進(jìn)行研究，轉(zhuǎn)錄組所表達(dá)的即為最真實(shí)的情況，因此在基因預(yù)測(cè)的過程中具有重要的作用。而由于轉(zhuǎn)錄表達(dá)的時(shí)空特異性與組織特異性，為了獲得更全面的信息是需要進(jìn)行多個(gè)組織部位混合檢測(cè)。
Question13：基因組做完之后可以開展什么研究？
Answer：基因組完成后可以進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，與近緣物種進(jìn)行宏觀進(jìn)化研究，其內(nèi)容主要包括：(1)?基因家族聚類，分析特有、共有基因和基因家族；(2)?基因家族擴(kuò)張收縮分析；(3)?系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；(4)?物種分化時(shí)間推算；(5)LTR形成時(shí)間估算（一般為植物基因組的分析項(xiàng)）；(6)全基因組復(fù)制事件（一般為植物基因組的分析項(xiàng)）；(7)選擇壓力分析；(8)共線性分析。具體可見漲知識(shí)啦！比較基因組學(xué)研究那些事
尾聲
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