Nanopore三代測序是一種單分子實(shí)時(shí)電信號測序技術(shù)，又稱為Isoform Sequencing（Iso-Seq），無需打斷，可直接讀取從5’端到3’端polyA尾的高質(zhì)量單個(gè)RNA分子全長序列。2018年，北京百邁客與牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，簡稱ONT）達(dá)成長期合作，基于ONT測序平臺進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用。目前，百邁客擁有MinION、GridION X5和PromethION三種型號全套納米孔測序儀。相比于二代RNA-Seq測序技術(shù)，ONT三代測序無/低GC含量偏好性，多比對效率低，可準(zhǔn)確識別可變剪接（AS），可選擇性多聚腺苷酸化（APA），基因家族，融合基因，lncRNA及其靶基因，而且可同時(shí)對基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量分析。
基于Nanopore測序平臺的優(yōu)勢，ONT全長轉(zhuǎn)錄組越來越受到廣大研究者的青睞，大家也越來越關(guān)注全長轉(zhuǎn)錄組研究應(yīng)用方向，以及如何充分利用ONT測序數(shù)據(jù)，發(fā)表高分高質(zhì)量文章。相較于農(nóng)學(xué)科研研究，ONT全長轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究方向日漸成熟，在各類疾病，如肺癌，白血病，精神病，腎病，乳腺癌等都有文章發(fā)表。今天小編跟大家分享一下ONT全長轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用方向和農(nóng)學(xué)經(jīng)典案例！
ONT全長轉(zhuǎn)錄組經(jīng)典應(yīng)用方向：
1. 完善基因組注釋：由于ONT測序鑒定出新基因，新的isoforms，在完善基因組注釋方面獲得關(guān)注。
2. 基因結(jié)構(gòu)的研究：可變剪接、APA、融合基因、基因家族、lncRNA及其靶基因預(yù)測。
1) 可變剪接事件的發(fā)生，使一個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而能夠翻譯成多種不同的蛋白。可變剪切是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要原因，是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要機(jī)制之一。它在在動(dòng)物的生長發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能等方面具有重要作用。
2) APA是指一個(gè)基因上有多個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)，從而使得一個(gè)基因可以產(chǎn)生多條帶有不同長度3’UTR的mRNA，或產(chǎn)生不同編碼序列的轉(zhuǎn)錄本，APA增加了轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性。APA影響胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、神經(jīng)元活性、免疫應(yīng)答、腫瘤形成與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。
3) 融合基因指兩個(gè)個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調(diào)控序列 (包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子等) 控制之下構(gòu)成的嵌合基因，由染色體重排產(chǎn)生，包括染色體易位、缺失、插入、顛倒等。研究表明，許多疾病、癌癥與融合基因的發(fā)生相關(guān)。
4) 真核生物轉(zhuǎn)錄組中存在大量長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），這些lncRNA可能在基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵性作用。挖掘lncRNA的序列、結(jié)構(gòu)、表達(dá)及功能信息是研究生物學(xué)問題必不可少的部分。
3. 基因功能研究：通過傳統(tǒng)Race獲得整個(gè)轉(zhuǎn)錄本全長，實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)、時(shí)間成本高，而通過三代測序可獲得全長，無需RACE實(shí)驗(yàn)。
4. 轉(zhuǎn)錄本定量：ONT全長轉(zhuǎn)錄組可同時(shí)對基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量，不需要二代數(shù)據(jù)輔助。而一些已知關(guān)鍵基因探索新功能，基因發(fā)生變異變化的是不同的轉(zhuǎn)錄本，不是整個(gè)基因的變化。而在進(jìn)行差異基因研究時(shí)，基因表達(dá)沒有差異，轉(zhuǎn)錄本定量可能會出現(xiàn)差異。
經(jīng)典案例解讀
成功案例一
英文題目：Comparative Analyses of Full-Length Transcriptomes Reveal Gnetum luofuense Stem Developmental Dynamics
中文題目：全長轉(zhuǎn)錄組的比較分析揭示了羅浮買麻藤莖的發(fā)育動(dòng)力學(xué)
發(fā)表期刊：Frontiers in genetics
影響因子：4.599
原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8027257/
主要實(shí)驗(yàn)方法和材料
材料：GLN01（莖尖，直徑=0.5-2mm）、GLN02（2-3 mm）、GLN03（3-4 mm）和GLN04（4-5 mm）。每個(gè)發(fā)育階段制備了三個(gè)重復(fù)樣品（兩個(gè)來自雌性個(gè)體，一個(gè)來自雄性個(gè)體）
測序平臺：MinION，共構(gòu)建12個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫。
主要研究結(jié)果與分析
1. AS和APA分析
在12個(gè)羅浮買麻藤莖樣本中檢測到總共24151個(gè)AS事件（圖2A）。其中，內(nèi)含子保留所占比例最大（7.793個(gè)事件；33.23%），而可變外顯子所占比例最?。?19個(gè)事件；1.32%）。內(nèi)含子保留數(shù)在GLN02期和GLN04期之間顯著增加（圖2B）。可變5’剪接位點(diǎn)在GLN03和GLN04之間顯著增加，而可變3’剪接位點(diǎn)和外顯子跳躍僅在GLN03中顯著增加（p值<0.05）。APA分析結(jié)果顯示，3’末端有5個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本所占比例最大（57194；42.56%），其次是只有一個(gè)位點(diǎn)（18948；14.02%）或兩個(gè)位點(diǎn)（16189；12.05%）的位點(diǎn)（圖2C）。APA事件的數(shù)量在整個(gè)買麻藤莖發(fā)育過程中也沒有顯著差異（圖2D）。在3’UTR上游50nt位置檢測到尿嘧啶（U）的富集，而在下游50 nt位置發(fā)現(xiàn)腺嘌呤（A）的富集，這表明所有poly(A)位點(diǎn)存在核苷酸偏倚（圖2E）。在所有轉(zhuǎn)錄本中，在poly（A）位點(diǎn)上游50 nt位置也檢測到三個(gè)保守基序（即AAAUGC、CCAUGC和CCAUCC）（圖2F）。
圖2 AS和APA事件的鑒定
2. CDS and lncRNAs分析
總共鑒定了38108個(gè)ORF，包括30323個(gè)（79.57%）完整的ORF，它們同時(shí)具有起始密碼子和終止密碼子。就完整的ORF而言，100-200 bp（12855個(gè)ORF）、0-100 bp（12150個(gè)）和200-300 bp（3751個(gè)）長度所占比例最大（圖3A）。共鑒定出728個(gè)lncRNAs，平均長度在298到4362 nt之間。這些lncRNAs進(jìn)一步分類為545個(gè)基因間區(qū)lncRNAs（74.86%）、28個(gè)反義lncRNAs（3.85%）、13個(gè)內(nèi)含子lncRNAs（1.79%）和142個(gè)正義lncRNAs（19.50%）（圖3C）。研究還發(fā)現(xiàn)，這些lncRNAs調(diào)控的順式靶基因比那些反式靶基因多（圖3D）。發(fā)現(xiàn)在GLN01和GLN03之間（Student t檢驗(yàn)，p=0.002），以及GLN01和GLN04之間（p=0.037），這些lncRNAs調(diào)控的順式靶基因顯著增加，而這些lncRNAs調(diào)控的反式靶基因在整個(gè)莖發(fā)育過程中未發(fā)現(xiàn)顯著變化。
圖3基于12個(gè)全長轉(zhuǎn)錄組的ORF和lncRNAs鑒定
3. TF and WGCNA Analyses
共鑒定出4251個(gè)TFs，屬于208個(gè)基因家族。其中最豐富的是AP2/ERF（176）、MYB相關(guān)（135）和bHLH（133）（圖4A），同時(shí)WGCNA分析也確定了與羅浮買麻藤莖發(fā)育高度相關(guān)的八個(gè)TFs模塊（圖4B、C）。綠松石色（編號1，315 TFs）、黑色（編號2，215 TFs）和黃色（編號7，75 TFs）最富集。綠松石色模塊中的TF主要在GLN01中表達(dá)，而黑色和黃色模塊中的TF分別在GLN02和GLN04中密集表達(dá)（圖4B、C）。很明顯，綠松石色模塊中的TFs主要通過三種KEGG途徑富集，“淀粉和蔗糖代謝”（11 TFs，ko00500）、“淀粉和蔗糖代謝”（8 TFs，ko00500）和“戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化”（6 TFs，ko00040）（圖4D）。類似地，黑色模塊中的TFs主要富集于“植物-病原體相互作用”（6 TFs，ko04626）、“碳代謝”（4TFs）和“苯丙烷生物合成”（4 TFs，ko00940），而黃色模塊中的TFs主要富集于“氰基氨基酸代謝”（2 TFs，ko00460）和“糖酵解/糖異生”（2 TFs，ko00010）。此外，還發(fā)現(xiàn)綠松石色模塊中bHLH、GRF和MYB相關(guān)蛋白高度表達(dá)；在黑色模塊中EGAP2/ERF、NAC和MYB高度表達(dá)；在黃色模塊中MYB、bZIP和PLATZ高度表達(dá)（圖4E）。
圖4 TFs的鑒定和WGCNA分析
4. DET s and K-Means Clustering
結(jié)果顯示GLN01和GLN04之間有492個(gè)DET，其中283個(gè)上調(diào)，209個(gè)下調(diào)（圖5A）。接著是GLN01和GLN02，GLN01和GLN03，分別有468個(gè)和136個(gè)。富集分析結(jié)果顯示，GLN01和GLN04之間的DET在三條KEGG途徑：“苯丙烷生物合成”（16個(gè)DET）、“淀粉和蔗糖代謝”（10個(gè)DET）和“氰基氨基酸代謝”（8個(gè)DET）中顯著富集（圖5C）。
然后，使用K-均值聚類算法將所有DET分為七類（圖5D）。結(jié)果表明，來自K7簇的轉(zhuǎn)錄物主要表達(dá)在頂端（GLN01），而其余簇，K3和K4，主要表達(dá)在GLN02和GLN04之間。這七個(gè)簇的轉(zhuǎn)錄本在多個(gè)GO術(shù)語中富集（圖5E），例如，K7簇轉(zhuǎn)錄物在“細(xì)胞壁生物發(fā)生”、“植物型細(xì)胞壁組織”和“細(xì)胞壁”術(shù)語中富集，來自K3簇的轉(zhuǎn)錄物在“調(diào)控莖尖分生組織發(fā)育”、“調(diào)控葉片發(fā)育”和“對內(nèi)源刺激的反應(yīng)”術(shù)語中富集，而來自K4簇的轉(zhuǎn)錄物在“氮化合物轉(zhuǎn)運(yùn)”、“脈管發(fā)育”和“光系統(tǒng)I”富集。
圖5 DET-s和DET-s的K-均值聚類分析
5. 總結(jié)
在羅浮買麻藤莖的12個(gè)全長轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測有24151個(gè)AS事件、134391個(gè)APA事件和728個(gè)lncRNAs。WGCNA和K-means聚類分析表明，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與一系列KEGG途徑有關(guān)，包括光合作用、氮運(yùn)輸和葉片個(gè)體發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)為與羅浮買麻藤相關(guān)的纖維和造紙工業(yè)提供了有價(jià)值的信息，并闡明了納米孔測序技術(shù)在裸子植物全長轉(zhuǎn)錄組研究中的應(yīng)用。
成功案例二
英文題目：Nanopore long-read RNAseq reveals regulatory mechanisms of thermally variable reef environments promoting heat tolerance of scleractinian coral Pocillopora damicornis
中文題目：ONT全長轉(zhuǎn)錄組揭示熱變化的珊瑚礁環(huán)境中促進(jìn)鹿角珊瑚耐熱性的調(diào)節(jié)機(jī)制
發(fā)表期刊：Environmental research
影響因子：6.498
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33503412/
主要實(shí)驗(yàn)方法與材料
材料：位于中國海南三亞灣鹿回頭邊緣礁石頭，高溫淺水區(qū)HP和氣溫深水區(qū)LP組中，每十個(gè)樣本中有兩個(gè)以等摩爾量混合以制備新樣本，以覆蓋更多樣本，即每組使用五個(gè)生物重復(fù)。
建庫測序：PromethION平臺，共構(gòu)建了10個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫（HP組的Q1-Q5和LP組的S1-S5）。
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
1. APA和AS鑒定
APA和AS的鑒定增強(qiáng)了我們對轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體多樣性生物學(xué)作用的理解。在本研究中，確定了9035例AS事件，并將其分為五類（圖2）。在檢測到的全部轉(zhuǎn)錄本中，有6.86%由某種可變剪切形式產(chǎn)生，其中內(nèi)含子保留是最常見的可變剪切事件。此外，在88092個(gè)基因位點(diǎn)上進(jìn)一步確定了207955個(gè)APA事件。
圖2 APA和AS鑒定
2. lncRNAs鑒定
有904個(gè)lncRNAs在Pfam、CPC、CNCI和CPAT都有鑒定到（圖3A）。對lncRNAs進(jìn)行分類和映射，發(fā)現(xiàn)基因間區(qū)的lncRNAs所占比例最多（688,76.1%）。
圖3 lncRNAs鑒定
3. lncRNAs和mRNAs在不同環(huán)境中的動(dòng)態(tài)表達(dá)
共鑒定出1390個(gè)mRNAs（671個(gè)上調(diào)，719個(gè)下調(diào)）和50個(gè)lncRNAs（22個(gè)上調(diào)，28個(gè)下調(diào)）（圖4B和C）。在本研究中，預(yù)測DE-lncRNAs與其靶mRNA協(xié)同發(fā)揮其功能，從而說明珊瑚對環(huán)境變化的適應(yīng)。對lncRNA靶向mRNAs進(jìn)行KEGG富集分析，以探索鹿角珊瑚lncRNAs的功能。根據(jù)KEGG分析，DE-lncRNA靶向mRNA在五條途徑中顯著富集（q值<0.05），如ko00603鞘糖脂生物合成-球狀系列、ko00531氨基糖降解、ko00604鞘糖脂生物合成-神經(jīng)節(jié)苷脂系列、ko00511其他聚糖降解、ko04142溶酶體、，ko00520氨基糖和核苷酸糖代謝，以及ko03013 RNA轉(zhuǎn)運(yùn)。
圖4 lncRNAs和mRNAs在不同環(huán)境中的動(dòng)態(tài)表達(dá)
4. 總結(jié)
珊瑚礁熱環(huán)境的變化促進(jìn)了鹿角珊瑚的耐熱性。本研究首次對APA和AS進(jìn)行了全面分析，并驗(yàn)證了鹿角珊瑚對熱變化礁環(huán)境的反應(yīng)中l(wèi)ncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的有效性，這可能在其熱適應(yīng)反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。此外，作者猜想熱變化的珊瑚礁環(huán)境通過代謝調(diào)節(jié)促進(jìn)了鹿角珊瑚的耐熱性，并且較低的代謝率與耐熱性的增加呈正相關(guān)。本文報(bào)告的數(shù)據(jù)提供了關(guān)于lncRNAs在鹿角珊瑚耐熱性中作用的重要信息，為進(jìn)一步闡明lncRNAs在無脊椎動(dòng)物環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)控mRNA表達(dá)的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，鹿角珊瑚在未來可能具有適應(yīng)氣候變化的潛力。
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