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英文題目：Comprehensive diagnostics of acute myeloid leukemia by whole transcriptome RNA sequencing
中文題目：全轉(zhuǎn)錄組RNA測序?qū)毙运柘蛋籽〉木C合診斷
期刊：Leukemia
影響因子：11.528
發(fā)表日期：2020.3.3
摘要
急性髓細(xì)胞白血病(AML)是由基因變異引起的，基因變異也控制著患者的預(yù)后，并指導(dǎo)風(fēng)險適應(yīng)和靶向治療。急性髓系白血病的遺傳變異在結(jié)構(gòu)上是多樣的，目前通過不同的診斷分析來檢測。本研究旨在建立全轉(zhuǎn)錄組核糖核酸測序作為AML診斷的單一、全面和靈活的平臺。我們開發(fā)了HAMLET(人類急性髓細(xì)胞白血病快速轉(zhuǎn)錄組學(xué))作為生物信息學(xué)管道，用于同時檢測fusion genes、small variants、tandem duplications和gene expression，所有信息都集中在一個被注釋的、簡易的輸出文件中。對100例急性髓系白血病患者進行了全轉(zhuǎn)錄組RNA測序，并通過reference assays和targeted resequencing驗證了HAMLET結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示，HAMLET z確地檢測到所有融合基因和過表達EVI1與3q26突變無關(guān)。此外，AML中經(jīng)常突變的13個基因的small variants有99.2%的敏感性和100%的特異性，以及FLT3和KMT2A的tandem duplications以100%的靈敏度和97.1%的特異性通過了新算法檢測?？傊琀AMLET有潛力成為在單一技術(shù)平臺上提供與AML分類、風(fēng)險評估和靶向治療相關(guān)的z確全面的診斷信息的平臺。
背景介紹
急性髓系白血病(AML)是由功能互補的基因突變引起的，這些突變導(dǎo)致髓系前體細(xì)胞不斷增殖和成熟被抑制。顯性 AML 平均攜帶13個非同義突變。造血干細(xì)胞中AML起始突變的獲得可能比AML診斷早幾十年。2016版的WHO classification of hematologic malignancies區(qū)分臨床和預(yù)后重要性的九種AML亞型。在50-55%的AML病例中進行對遺傳變異的風(fēng)險評估的z確分類，并可能指導(dǎo)靶向治療。在80-85%的AML病例對重復(fù)突變基因的擴展組的基因組進行分類。
然而，急性髓細(xì)胞白血病的z確分類需要不同的技術(shù)來捕獲結(jié)構(gòu)多樣的基因突變，如較大的插入和缺失(indels)、融合基因和除小變異外的結(jié)構(gòu)性染色體變異。此外，結(jié)構(gòu)正常基因的表達水平可對預(yù)后產(chǎn)生決定性影響。因此，在當(dāng)前的技術(shù)平臺下，急性髓細(xì)胞白血病診斷及風(fēng)險評估仍然繁瑣、貴，且不完整。為了解決這一需求，我們實施了全轉(zhuǎn)錄組RNA測序(mRNAseq)，作為獲取與當(dāng)前和未來分類和風(fēng)險分類相關(guān)的所有遺傳信息的單一平臺。在這種診斷范式中，一個經(jīng)認(rèn)可的mRNAseq協(xié)議獲取診斷樣本的全面數(shù)據(jù)。對于單次運行數(shù)據(jù)分析，我們開發(fā)了一個指定的集成生物信息管道(人類急性髓細(xì)胞白血病快速轉(zhuǎn)錄組學(xué)(HALLET)；Fig. 1)。HAMLET具有靈活的適應(yīng)性和個性化，可以查詢一組選定基因的序列變異和表達水平，以及易位情況。
實驗材料
從萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(LUMC)的血液學(xué)生物庫中選擇了100份經(jīng)機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)獲得的冷凍保存的急性髓系白血病樣本。所有樣本都進行了基因分型NPM1突變和FLT3內(nèi)部串聯(lián)復(fù)制(FLT3-ITD)由LUMC分子診斷實驗室認(rèn)證。
實驗方法
全轉(zhuǎn)錄組測序，HAMLET輸出的驗證
結(jié)果
經(jīng)認(rèn)證的mRNAseq在100個AML樣本上產(chǎn)生了4885萬個reads(9700-17000萬個reads)，平均插入大小為149-177個堿基。質(zhì)量控制后的平均閱讀長度為123–124個堿基。
融合基因檢測
HAMLET在24例病例中z確檢測到中期細(xì)胞遺傳學(xué)預(yù)測的所有復(fù)發(fā)融合基因(Fig. 2a)。另外3例除t(9;11)(p21;q23)外的11q23易位病例，HAMLET正確識別了KMT2A融合相關(guān)基因MLLT1,MLLT4，和MLLT6(圖1，2)。此外，HAMLET在8例病例中正確識別了融合轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本不能通過中期核型分析預(yù)測，但與急性髓系白血病的預(yù)后相關(guān)(圖2b)。FUS-ERG 檢測到融合基因，其對應(yīng)的t(16；21)(p11；q22)僅在其復(fù)雜核型中被鑒定。攜帶ETV6-LYN融合基因的AML(2-020)的核型為add(8)(q24)和del(12)(p13)，但缺乏特征ins(12;8)(p13;q11q21)。三個AML (2-003，2-031，2-032)發(fā)現(xiàn)NUP98-NSD1融合轉(zhuǎn)錄本。由于兩個參與基因的端粒位置NUP98-NSD1源于t(5；11)(q35；p15.5)，因此目前未被AML分類，盡管其與不良預(yù)后相關(guān)。在三個病例(2-053、3-021、3-024)中發(fā)現(xiàn)PIM3-SCO2發(fā)生了基因融合。此前已在兒童急性髓系白血病中發(fā)現(xiàn)，可起源于慢性中性粒細(xì)胞白血病的0.6 Mb號染色體倒位。
HAMLET提供了融合轉(zhuǎn)錄物的詳細(xì)信息，包括差異剪接(KMT2A-MLLT3、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARA、CBFB-MYH11和NUP98-NSD1)和來自平衡易位的相互轉(zhuǎn)錄物，例如，RARA-PML, ERG-FUS, NUP214-DEK, 和 NSD1-NUP98?？傊?，HAMLET檢測到54種不同的融合轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄物不能通過中期核型分析預(yù)測?？偟膩碚f，28例急性髓系白血病攜帶兩個或多個融合，在一個復(fù)雜的AML中*多有9個不同的融合基因。
small variants檢測
HAMLET的VARSCAN組件在13個AML基因中鑒定出246個小變異體。HAMLET對NPM1和DNMT3A的FLT3-ITD和熱點區(qū)域進行了敏感性評估，對其余的418個被HAMLET稱為野生型的樣本進行了靶向重測序反應(yīng)。VARSCAN只識別了七個相當(dāng)短的FLT3-34人中的ITDFLT3-ITD攜帶AML。在這種情況下，HAMLET都正確地識別了一個ASXL1(3-030)的30bp C末端插入和CEBPA (3-003)中一個N端易位。HAMLET檢測到的小變異體的總體類型和分布與在COSMIC中報告的分布非常一致。
HAMLET檢測的變異在COSMIC中列出并位于定義的遺傳熱點內(nèi)，很容易被解釋為A類變異(n = 114;46.3%)。COSMIC中報告了60種變異(24.4%)，但沒有位于熱點。這些B類變異大部分在已知突變發(fā)生在整個編碼序列中的基因中被檢測到(CEBPA,TET2，RUNX1,WT1和TP53).其余變異并未報告(C類變異體:n= 52;21.1%)或未在COSMIC中列出但被描述為SNP(D類變異體，n= 20;8.1%).D類變異可能代表真正的低等位基因頻率的遺傳多態(tài)性。C類變異體可以根據(jù)其預(yù)測的致病作用來解釋。按這種規(guī)定進行解釋，90%以上的A類變異，50%的B類和C類變異體和小于1%的D類變異體是髓系惡性腫瘤的復(fù)發(fā)突變。
在TCGA AML隊列中，基因組DNA中存在的小變體已被證明在相應(yīng)的RNA序列分析中是不存在的。因此，我們驗證了小變異的HAMLET結(jié)果RUNX1,TET2,TP53,DNMT3A,KIT1，和IDH1通過靶向NGS對從56例急性髓系白血病分離的基因組DNA。選擇這些病例是因為TP53，RUNX1和TET2的遺傳特征與基因突變增加的可能性有關(guān)，在這56例AML病例中，HAMLET檢測到67個變異，包括18個易位，它們是無義介導(dǎo)的RNA衰變的潛在靶點。在這67個變體中，有一個TET2三例急性髓系白血病病例中的變異體(c.4317dup)被目標(biāo)NGS遺漏。這個A插入發(fā)生在6個其他A核苷酸的延伸中，顯然很難在Ion GeneStudio S5系統(tǒng)上進行排序。原始數(shù)據(jù)中存在這種變異的Reads，等位基因頻率為2-3%。還有兩個變異被目標(biāo)NGS發(fā)現(xiàn)，但被HAMLET錯過了。這些變異包括RUNX1是已被靶向NGS檢測到的錯義變異體，具有10%的低等位基因頻率和IDH1?？傊覀兊臄?shù)據(jù)顯示，HAMLETz確地調(diào)用了TET2,TP53,RUNX1,KIT,IDH1和DNMT3A包括由轉(zhuǎn)錄物編碼的所有變異，這些轉(zhuǎn)錄物是無義介導(dǎo)的衰變的潛在目標(biāo)。我們還確定了HAMLET-RNAseq檢測所需的測序深度，并對100個急性髓系白血病進行了20萬、30萬、40萬和4750萬個讀對的流水線操作。在HAMLET所稱的246個變異中，有53個變異是無義突變或移碼突變。HAMLET檢測這些變異的z確度從100%、96%、85%下降到70%，而其余變異體的z確度從100%、98%、96%下降到81%。這些數(shù)據(jù)表明，約測5000萬個reads的高測序深度對于確保檢測所有變異類型是必不可少的。
等位基因的CEBPA突變?yōu)楹诵驼５腁ML帶來了良好的預(yù)后并且將一個等位基因上編碼序列的第一個357 bp內(nèi)的N-末端移碼突變與c.834-1074之間的C-末端框內(nèi)插入或缺失相結(jié)合，從而破壞另一個等位基因上的DNA結(jié)合。通過Illumina平臺上通?？色@得的reads長度來證明它們在相反染色體上的位置。然而，雙等位基因CEBPA突變與特定的基因表達譜有關(guān)?；趍RNAseq的基因表達譜顯示了特征性的雙等位基因CEBPA攜帶兩個樣本的所有四個急性髓系白血病樣本的突變相關(guān)特征CEBPA突變(2-009、2-039、2-045和3-003)，包括其C端突變被HAMLET遺漏的病例3-003(圖3)。11例急性髓系白血病中，有一例CEBPA變異，一個病例(2-025)的特征性N-末端移碼突變與雙聚在一起CEBPA變異。因此，將變異檢測與基因表達譜結(jié)合分析，可以單獨解決變異檢測的不確定性。由于CEBPA 雙突變體的基因標(biāo)記不是定量的，所以尚未在HAMLET中實施臨床應(yīng)用。
檢測中的串聯(lián)重復(fù)FLT3和KMT2A
外顯子中常見串聯(lián)重復(fù)的可靠檢測FLT3在急性髓系白血病診斷中尤為重要，因為FLT3-ITD是酪氨酸激酶抑制劑治療的適應(yīng)癥。除了對FLT3-ITD，其位置、大小和突變與等位基因比率對急性髓系白血病的預(yù)后有重要影響。為了改善對不充分的檢測FLT3-ITD通過VARSCAN，我們開發(fā)了ReSCU作為一種新的算法，該算法基于在相互基因位置發(fā)生的部分對齊、SC reads的調(diào)用。
ReSCU確定了36例有FLT3-ITD，包括由VARSCAN檢測到的所有7例small ITD病例和經(jīng)認(rèn)證診斷確定的所有34例病例(圖4a)。NGS的有針對性的重新排序進一步證實了FLT3-除了兩種情況之外，所有情況下，ITD都處于軟限幅方法確定的位置(表SXIV).在兩個由ReSCU調(diào)用但不是由標(biāo)準(zhǔn)診斷調(diào)用的不一致案例中，SC reads占其各自位置總覆蓋率的小于1%。仔細(xì)審查原始數(shù)據(jù)顯示FLT3-在這兩種情況下，ITD信號都低于檢測閾值，表明HAMLET的靈敏度更高(圖S6).突變型與正常型的等位基因比FLT3片段與ReSCU調(diào)用的SC reads百分比有很好的相關(guān)性(圖4b).
KMT2A-PTD外顯子2–13，這對于將AML 分類到染色質(zhì)剪接組，導(dǎo)致蛋白質(zhì)延長，對AML的臨床結(jié)果產(chǎn)生不利影響。ReSCU識別的KMT2A-PTD外顯子2-8和2-10分別出現(xiàn)在4和2病例中，外顯子2、2-3和3-6的重復(fù)出現(xiàn)在單個病例中(圖4c)。全部九個KMT2A-PTD通過 RT-PCR和測序進行驗證。
基因過表達的檢測
結(jié)構(gòu)正?；虻倪^度表達會影響急性髓系白血病患者的預(yù)后BAALC, ERG, MN1, DNMT3B, SPARC, and EVI1。mRNAseq測量過表達的可靠性被評估為預(yù)示AML預(yù)后非常差的EVI1轉(zhuǎn)錄本(圖5a)。過表達EVI1可由inv(3)(q21q26)或t(3;3)(q21;q26)，但是存在替代的分子機制。mRNAseq檢測到的EVIl外顯子1的表達與定量RT-PCR檢測結(jié)果有很好的相關(guān)性(圖5b).兩例(1- 005,3 -029)攜帶inv(3)(q21q26)和1例(1-008)攜帶t(3;8)(q26;q24)均可見高EVI1表達。在另外4例EVI1高表達的病例中，1例有der(3)t(1;3)(q3?1;q2?5)，沒有可識別的MECOM1位點參與(病例3-022)。這3例EVIl過表達而無3q26異常的病例均攜帶KMT2A融合轉(zhuǎn)錄本(case 1-001和3-008:KMT2A-MLLT3；case2-047:KMT2A-MLLT4)。這種遺傳變異的組合表明AML的預(yù)后極差。
Fig. 5 Detection of EVI1 overexpression. a Schematic representation of two mRNA transcripts from the MECOM locus on chromosome 3. One transcript contains exon 1–2 of MDS1 fused to exon 2–15 of EVI1 (MDS1-EVI1 transcript), whereas the other transcript contains exon 1–15 of EVI1 (EVI1 transcript). b Comparison of EVI1 expression by RNAseq and quantitative RT-PCR. Xaxis: Expression of the first exon of EVI1 normalized for expression of the PBGD housekeeping gene by quantitative RT-PCR (log2 EVI1/PBGD). Y-axis: Sum of base coverage of the first exon of EVI1 per kb transcript and one million mapped reads (log2 BPKM) by RNAseq
克隆進化
HAMLET揭示了克隆進化，在診斷和復(fù)發(fā)時采集的所有四對樣本中獲得和丟失了遺傳變異。盡管基因型明顯不同，但IDH2突變作為起始事件的持續(xù)存在確立了新生AML和后續(xù)治療相關(guān)AML的共同起源(case 3-021、3-038)。因此，一個獨立的、與治療相關(guān)的AML的診斷被糾正為原始AML的復(fù)發(fā)，盡管兩個樣本將被分類為不同的AML亞型。
急性髓系白血病的分類和預(yù)測
根據(jù)HAMLET和中期核型分析結(jié)果，99例病例可根據(jù)世衛(wèi)組織2016年和基因組分類進行重新分類(圖6)。HAMLET信息促進了6個案例的風(fēng)險重新評估，值得注意的是通過NUP98-NSD1融合而無分類明確病變的AML，或通過EVIl過表達而無inv(3)(q21q26)來分配風(fēng)險。
原文鏈接：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32127641
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