人多能干細(xì)胞與食蟹猴離體胚胎的嵌合體研究

摘要

用人多能干細(xì)胞（hPSC）形成種間嵌合體已成為在體內(nèi)評(píng)估hPSC多能性的有效方案，并且 可能在再生醫(yī)學(xué)，包括移植器官和組織再生中發(fā)揮重要作用。使用小鼠和豬胚胎的研究表明， hPSCs并不能有力地促進(jìn)與人類進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的物種的嵌合體形成。本研究主要是在體外培養(yǎng)的 食蟹猴（Macaca fascicularis）胚胎中研究人擴(kuò)展多能干細(xì)胞（hEPSC）的嵌合能力，證明 hEPSCs能夠在食蟹猴胚胎中存活、增殖，并繪制植入前后細(xì)胞圖譜。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了種間細(xì)胞相 互作用，這些事件可能有助于塑造嵌合胚胎內(nèi)人類和食蟹猴細(xì)胞的獨(dú)特發(fā)育軌跡。本研究結(jié)果 可能有助于更好地了解早期人類胚胎發(fā)育和靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)化，并制定策略以改善進(jìn)化距離較遠(yuǎn) 的物種的人類嵌合體的形成。

研究背景

多能干細(xì)胞（PSC）能夠進(jìn)行無(wú)限的自我更新并產(chǎn)生所有成體細(xì)胞類型（De Los Angeles et al., 2015; Hackett and Surani, 2014; Rossant and Tam, 2017; Wu and Izpisua Belmonte, 2016）。PSCs 可通過(guò)囊胚互補(bǔ)進(jìn)行種間器官再生，這種技術(shù)有潛力為包括器官移植在內(nèi)的再生醫(yī)學(xué)提供大量 體內(nèi)生成的人類細(xì)胞、組織和器官（Suchy and Nakauchi, 2018; Wu et al., 2016）。成功的種間囊 胚與人類 PSC（hPSC）互補(bǔ)的要求之一是它們能夠形成嵌合體。hPSCs的嵌合能力已在幾種物 種中進(jìn)行了測(cè)試（Wu et al., 2016），雖然不同實(shí)驗(yàn)室都在持續(xù)努力，但普遍的共識(shí)是在與人類 進(jìn)化距離很遠(yuǎn)的物種上（e.g., mice and pigs; Wu et al., 2016, 2017），hPSCs 并不能始終如一地、 有力地促進(jìn)嵌合體的形成，即使人類細(xì)胞凋亡受到抑制，結(jié)果也是一樣（Das et al., 2020; Huang et al., 2018; Wang et al., 2018）。hPSCs和進(jìn)化距離很遠(yuǎn)的物種之間的異種屏障被認(rèn)為是限制嵌合 體形成的原因（Wu et al., 2016, 2017），但尚無(wú)hPSCs與進(jìn)化上接近人類的物種中進(jìn)行嵌合體的研究。體外培養(yǎng)的PSC反映了體內(nèi)多能性，體外不同的細(xì)胞培養(yǎng)方案導(dǎo)致細(xì)胞不同的多能性狀態(tài) （Morgani et al., 2017; Smith, 2017; Weinberger et al., 2016）。處于不同多能狀態(tài)的hPSC表現(xiàn)出不 同的轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和代謝特征，當(dāng)它們被引入動(dòng)物胚胎時(shí)，它們的嵌合潛力也不同（De Los Angeles, 2019; Harvey et al., 2019; Zhang et al., 2018）。最近研究發(fā)現(xiàn)人類擴(kuò)展多能干細(xì)胞 （hEPSC）在小鼠中表現(xiàn)出較高的嵌合能力（Gao et al., 2019; Yang et al., 2017）， 然而尚未在其 他物種中確定hEPSCs的嵌合能力。 利用新開發(fā)的培養(yǎng)體系，食蟹猴胚胎可離體培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)20天（Ma et al., 2019; Niu et al., 2019）。將hEPSCs顯微注射到食蟹猴囊胚中，并在不同時(shí)間點(diǎn)觀察其對(duì)食蟹猴胚胎的作用（見 下圖），結(jié)果發(fā)現(xiàn)hEPSCs可以整合到晚期食蟹猴囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICMs）中，同時(shí)還通過(guò)單細(xì) 胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）分析確定了體外培養(yǎng)過(guò)程中食蟹猴胚胎中hEPSCs的分化軌跡。

材料方法

卵母細(xì)胞采集和體外受精

參考已發(fā)表文章（Mishra et al., 2010）進(jìn)行卵巢刺激、卵母細(xì)胞恢復(fù)和體外受精。健康雌 性食蟹猴通過(guò)肌肉注射20 IU重組人促卵泡激素α（rhFSH, Gonal F, Merck Serono）8 天，然后 在第9天注射1,000 IU重組人絨毛膜促性腺激素α（rhCG, OVIDREL, Merck Serono）刺激卵 泡。在給予rhCG后32-35小時(shí)，通過(guò)腹腔鏡收集卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物。將卵泡內(nèi)容物置于 37℃含有0.3%牛血清白蛋白（BSA）的Tyrode乳酸丙酮酸白蛋白（TALP）培養(yǎng)基中，在短暫
暴露于透明質(zhì)酸酶（<1 分鐘）后，在TALP-HEPES中通過(guò)移液器將卵母細(xì)胞剝離出卵丘細(xì)胞 （0.5 mg/mL），選擇核成熟中期II（MII；存在第一個(gè)極體）卵母細(xì)胞。成熟的卵母細(xì)胞立即 進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI），然后在37℃含有5% CO2的10% 胎牛血清（FBS, GIBCO） 的CMRL-1066培養(yǎng)基（GIBCO, 11530037）中培養(yǎng)，第二極體和兩個(gè)原核的生成證實(shí)了體外受 精成功，然后將受精卵在含有5% CO2的10% 胎牛血清的HECM-9培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)。除非 另有說(shuō)明，所有試劑均來(lái)自 Sigma Chemicals。

將hEPS細(xì)胞顯微注射到食蟹猴囊胚并進(jìn)行體外胚胎培養(yǎng)

將受精后第6天的囊胚（早期囊胚）轉(zhuǎn)移到覆蓋有3 mL礦物油的培養(yǎng)皿中心的50 mL TH3液 滴中。將hEPS細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液注入10 uL培養(yǎng)基液滴中。將25個(gè)tdTomato陽(yáng)性hEPS細(xì)胞吸入 內(nèi)徑為30°斜口的15 mm注射移液管中。使用單個(gè)激光脈沖消融透明帶，并將含有hEPS細(xì)胞的 注射移液管立即插入囊胚的孔中，靠近 ICM。將注射的囊胚快速轉(zhuǎn)移到HECM-9和hEPS（1:1） 的混合培養(yǎng)基中（Yang et al., 2017b），并培養(yǎng)24小時(shí)至膨脹良好的囊胚階段。

人猴嵌合胚胎體外培養(yǎng)

選擇tdTomato陽(yáng)性人猴嵌合胚胎進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。人猴嵌合胚胎的透明帶可通過(guò)暴露于來(lái)自 牛睪丸的透明質(zhì)酸酶約30 s而去除，然后將胚胎接種在含有IVC1培養(yǎng)基的8孔板（80826，Ibidi） 中。胚胎附著在孔上后，將一半的IVC1更換為IVC2培養(yǎng)基，此后，每天用新鮮的IVC2更換一半 的培養(yǎng)基，并在指定的日期收獲猴胚胎。IVC1和IVC2的成分見已經(jīng)發(fā)表文章（Niu et al., 2019）。

單細(xì)胞收集和單細(xì)胞RNA-seq (scRNA-seq)

用磷酸緩沖液（PBS）（MA0008，美倫生物）洗滌后，用1mL注射器將胚胎切成幾塊。在 熒光顯微鏡（Leica）下挑取tdTomato陽(yáng)性和陰性組織，用0.1%胰蛋白酶（25200-072，GIBCO） 在37°C消化3-5分鐘制成單細(xì)胞懸液。2% FBS（04-002-1A, Biological Industries）中和后，用含 有0.1至1% BSA的預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞。最后，使用熒光顯微鏡用吸管將單個(gè)tdTomato陽(yáng)性和陰性 細(xì)胞挑入冰上預(yù)冷的裂解緩沖液中。

通過(guò)吸管將單細(xì)胞放入裂解緩沖液中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和預(yù)擴(kuò)增分別使用SuperScript II（18064- 071, Invitrogen）和KAPA HiFi HotStart Ready Mix（KK2602, KAPA Biostems）進(jìn)行，然后進(jìn)行20 個(gè)PCR循環(huán)以獲得20-140 ng的cDNA。通過(guò)Tn5轉(zhuǎn)座酶（TD502/TD501，Vazyme）在 55°C混合10 分鐘將cDNA片段化，然后使用TruePrep 擴(kuò)增酶（TD601，Vazyme）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用AM Pure XP 磁珠（A63881, Beckman Coulter）純化文庫(kù)并進(jìn)行大小選擇。所有文庫(kù)均適用于Illumina X- Ten測(cè)序平臺(tái)（由Annorad測(cè)序）。

免疫熒光（IF）

IF參考之前發(fā)表的內(nèi)容（Niu et al., 2019）。收獲體外培養(yǎng)的人猴嵌合胚胎，在4%（w/v） 多聚甲醛（BL539A，Biosharp）的PBS溶液中室溫固定30分鐘，用PBS洗滌。d.p.f.9胚胎直接染 色，d.p.f.11至19的胚胎在蔗糖（BGC005，美倫生物）溶液中脫水6小時(shí)，濃度從15%（w/v）增 加到30%（w/v），使用OCT（4583，Tissue-Tek OCT，SAKURA）包埋，-80℃冷凍，將胚胎制 備為8 mm厚的冷凍切片后，放在預(yù)處理過(guò)的載玻片（1A5105，CITOTEST）上，風(fēng)干1小時(shí)。在 室溫下PBST（含 0.3% Triton X-100 的 PBS）（T9284，Sigma-Aldrich）中透化30分鐘，樣品用 3%（w/v）BSA 和10%（v/v）FBS 封閉（04-001-1A, Biological Industries）在PBS 中，4℃下與一 抗一起孵育過(guò)夜，然后洗滌至少3次后，熒光偶聯(lián)的二抗、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）與 載玻片在室溫下避光孵育2小時(shí)。使用Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡拍攝圖像。

統(tǒng)計(jì)分析

所有值均表示為平均值±SD，包括圖例和補(bǔ)充圖例中統(tǒng)計(jì)分析、統(tǒng)計(jì)顯著性和n值在內(nèi)的 統(tǒng)計(jì)參數(shù)。使用Prism軟件（GraphPad）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單向方差分析，顯著性p < 0.05。

細(xì)胞來(lái)源識(shí)別、scRNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)處理和質(zhì)量控制

首先通過(guò)兩種不同的方法識(shí)別人和猴細(xì)胞。 一種是隨機(jī)選擇的10000條reads通過(guò)blastp與人 類或食蟹猴基因組（Ensembl Homo_sapiens.GRCh38和Macaca_fascicularis_5.0）進(jìn)行比對(duì)；另一 個(gè)是比對(duì)到tdTomato序列的測(cè)序reads。在確定細(xì)胞來(lái)源后，使用hisat2（Kim et al., 2019）將測(cè)序 reads比對(duì)到人類或猴子基因組，使用StringTie（Pertea et al., 2015）組裝轉(zhuǎn)錄本，并計(jì)算基因表 達(dá)量（TPM）。

細(xì)胞聚類、譜系鑒定

Seurat包（v.3.1.1）（Butler et al., 2018）用于單細(xì)胞聚類分析，并用t-SNE來(lái)可視化結(jié)果。 參考數(shù)據(jù)集包括Human-1（Zhou et al., 2019）、Human-2（Xiang et al., 2020）、monkey-1（Niu et al., 2019）和monkey-2（Nakamura et al., 2016）。除非另有說(shuō)明，Control-monkey的參考數(shù)據(jù)集為 monkey-1。本研究中的嵌合體數(shù)據(jù)按照以下步驟整合到上述參考數(shù)據(jù)集中，首先，將這些數(shù)據(jù) 集分別創(chuàng)建為Seurat對(duì)象，順序?yàn)镠uman-1、Human-2、monkey-1、chimera-human和chimera- monkey；然后使用“FindIntegrationAnchors”函數(shù)將這些對(duì)象作為輸入，參數(shù)為“k.anchor = 5， anchor.features = 2000”；最后使用“IntegrateData”函數(shù)將所有數(shù)據(jù)集與默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行整合。 Seurat使用前20個(gè)主成分（PC）進(jìn)行聚類（分辨率為 0.6），每個(gè)cluster使用“FeaturePlot”函數(shù) 在t-SNE圖上突出顯示的特定標(biāo)記基因定義，并由先前研究中的已知譜系證實(shí)。

差異基因鑒定

通過(guò)運(yùn)行Seurat的“FindAllMarkers”和“FindClusters”功能（p <0.01）來(lái)鑒定獨(dú)特的cluster 特異性表達(dá)基因。K-近鄰算法SPRING（Weinreb et al., 2018）用于軌跡分析，以集成數(shù)據(jù)、2000
個(gè)高度可變基因（HVG）和默認(rèn)參數(shù)作為輸入。為了構(gòu)建所有嵌合細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)育樹，將基因 表達(dá)矩陣輸入MEGA (X 10.1)（Kumar et al., 2018）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

擬時(shí)序分析和擬時(shí)序依賴性差異表達(dá)基因分析

Monocle2（v2.12.0）（Trapnell et al., 2014）用于構(gòu)建所有EPI細(xì)胞的擬時(shí)序分析。用EPI譜 系 中 人 、 猴 和 嵌 合 細(xì) 胞 的 2000 個(gè) HVG 和 表 達(dá) 數(shù) 據(jù) 用 作 Monocle2 的 輸 入 ， 通 過(guò) 參 數(shù) “max_components=2”的“reduceDimension”函數(shù)降低維度，將表達(dá)數(shù)據(jù)投影到低維空間后， 通過(guò)“orderCells”函數(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序，最后使用DTW算法來(lái)對(duì)齊人類、食蟹猴和嵌合細(xì)胞之 間的不同擬時(shí)序過(guò)程，如先前研究（Kanton et al., 2019）中所述。擬時(shí)序?qū)R數(shù)據(jù)后，使用基于 F檢驗(yàn)的ANOVA分析來(lái)識(shí)別具有擬時(shí)序依賴性表達(dá)模式的基因，如前所述（Kanton et al., 2019）。對(duì)于每個(gè)HVG，建立一個(gè)具有六個(gè)自由度（df）的自然線性回歸模型（R包splines中的 ns函數(shù)），以表達(dá)水平作為響應(yīng)變量，偽時(shí)間作為自變量。對(duì)測(cè)試基因進(jìn)行Bonferroni校正，校 正P值為0.01。此外，R包slingshot（v1.1-2）用于推斷具有默認(rèn)設(shè)置的嵌合人類EPI-like細(xì)胞和 hEPS的潛在發(fā)展軌跡（Street et al., 2018）。

GO和KEGG分析

使用clusterProfiler R包（Yu et al., 2012）進(jìn)行KEGG通路（Kanehisa, 2019; Kanehisa and Goto, 2000; Kanehisa et al., 2019）和GO富集分析，P≤0.05被認(rèn)為是顯著富集的。使用R包中“ggplot” 函數(shù)進(jìn)行可視化。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

SCENIC 包（Aibar et al., 2017）可用于推斷和表征嵌合體細(xì)胞scRNA-seq數(shù)據(jù)的基因調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)。根據(jù)網(wǎng)站（https://github.com/aertslab/SCENIC）的指導(dǎo)手冊(cè)，共三個(gè)步驟：1.基于嵌入式 GENIE3的轉(zhuǎn)錄因子與潛在目標(biāo)基因推斷之間的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；2.對(duì)于每個(gè)共表達(dá)模塊，RcisTarget 對(duì)所有潛在靶基因進(jìn)行順式調(diào)控motif富集分析，每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因被定義為一個(gè)調(diào)節(jié) 子；3.通過(guò)AUCell計(jì)算每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)調(diào)節(jié)子的活動(dòng)分?jǐn)?shù)。本研究將所有嵌合細(xì)胞的表達(dá)譜輸 入SCENIC，以推斷它們的AUC調(diào)節(jié)子活性，然后嵌合細(xì)胞基于它們的調(diào)節(jié)子活性和pheatmap （v1.0.10）的“pheatmap”功能進(jìn)行聚類。為了比較，上述數(shù)據(jù)集Human-1和monkey-1也使用相 同的調(diào)節(jié)子活性分析。

RNA速度分析

RNA速度是使用Velocyto.R程序（http://velocyto.org）根據(jù)之前報(bào)道的拼接和未拼接轉(zhuǎn)錄本 reads計(jì)算的（La Manno et al., 2018）。Velocyto使用BAM文件來(lái)計(jì)算拼接和未拼接的reads，并 生成Loom 文件，然后使用“read.loom.matrices”函數(shù)將這些文件加載到R中，以生成用于拼接 和非拼接讀取的計(jì)數(shù)表，使用具有K-近鄰細(xì)胞池（kCells = 10）的基因相關(guān)模型估計(jì)RNA速度。

嵌合胚胎內(nèi)人和猴細(xì)胞間相互作用的鑒定

使用CellPhoneDB（v2.0.1）基于配體-受體對(duì)，分析不同胚胎譜系中人和猴細(xì)胞之間的信號(hào) 傳遞（Vento-Tormo et al., 2018）。CellPhoneDB中所有配體-受體相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)都用于本次數(shù) 據(jù)分析。將所有嵌合細(xì)胞的表達(dá)譜及其信息，包括細(xì)胞類型（人類或猴細(xì)胞）和譜系信息 （EPI、HYP 和 EXMC）輸入 CellPhoneDB，以推斷兩種類型細(xì)胞之間的潛在相互作用。使用校 正后的P＜0.05作為閾值來(lái)識(shí)別兩種類型細(xì)胞之間特異性表達(dá)的配體/受體，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn) 值。為了進(jìn)行比較，上述數(shù)據(jù)集Human-1和monkey-1也進(jìn)行相同分析。

結(jié)果

1、體外人猴嵌合囊胚的形成

為確定非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中hPSC的嵌合能力，本研究使用了通過(guò)細(xì)胞重編程產(chǎn)生的特征明 確的hEPSC系iPS1-EPSC，它在小鼠胚胎第10.5天（E10.5）表現(xiàn)出優(yōu)于其他hPSC（Yang et al., 2017）的嵌合性。與之前的報(bào)告一致，iPS1-EPSCs表現(xiàn)出圓頂形集落形態(tài)，并表達(dá)核心多能性 轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG和SOX2（圖 S1A）。為了生成人猴嵌合胚胎，對(duì)食蟹猴的早期囊胚 （受精后 6 天 [d.p.f.6]）注射了25個(gè)用tdTomato（TD）標(biāo)記的iPS1-EPSC，注射的胚胎培養(yǎng)到 晚期囊胚階段（d.p.f.7）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)食蟹猴囊胚內(nèi)hEPSC的增殖很明顯?？偟膩?lái)說(shuō)，在所 有d.p.f.7的食蟹猴囊胚中檢測(cè)到TD+ iPS1-EPSCs（100%，n = 132）（圖 S1B）。

圖S1 宿主食蟹猴胚胎中hEPSCs的譜系規(guī)范

2、hEPSCs在食蟹猴胚胎中的嵌合作用

最新建立的延長(zhǎng)胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)可支持靈長(zhǎng)類動(dòng)物（人和猴）的離體胚胎發(fā)育到原腸胚階段 （Deglincerti et al., 2016; Ma et al., 2019; Niu et al., 2019; Shahbazi et al., 2016; Xiang et al., 2020;Zhou et al., 2019）。在這個(gè)胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)中，透明帶被去除，裸露的囊胚附著在培養(yǎng)皿上進(jìn)一 步發(fā)育，可使用該系統(tǒng)來(lái)追蹤移植前后食蟹猴胚胎中hEPSC的分化。大約d.p.f.10左右，注射了 hEPSCs（92.79%, n = 111）的胚胎與未注射的對(duì)照（92.31%, n = 104）（Niu et al., 2019）類 似。附著后，注射的胚胎繼續(xù)生長(zhǎng)，胚胎盤在大約d.p.f.11時(shí)變得可見（圖 1B）。在d.p.f.9 時(shí)，超過(guò)一半的胚胎中發(fā)現(xiàn)了TD+人類細(xì)胞，但這個(gè)比率在d.p.f.13時(shí)逐漸下降約1/3（圖 1C）。為了確定引入的hEPSC是否會(huì)影響胚胎發(fā)育，本研究評(píng)估并比較了注射胚胎和對(duì)照胚胎 的發(fā)育狀態(tài)（Niu et al., 2019），發(fā)現(xiàn)注射胚胎的發(fā)育比率略低于對(duì)照（圖 1D）。此外，與對(duì) 照類似，注射胚胎的發(fā)育比率在大約 d.p.f.15 時(shí)急劇下降，這可能反映了2D附著胚胎培養(yǎng)系統(tǒng) 的局限性（圖 1D）。

圖1 人猴離體嵌合體的產(chǎn)生和發(fā)育能力

為研究食蟹猴胚胎中hEPSC的發(fā)育潛力，本研究使用幾種胚胎和胚胎外譜系特異性抗體進(jìn) 行了免疫熒光（IF）研究。在圍植入期（d.p.f.9），平均有10.2±7.2（n = 9）個(gè)iPS1-EPSCs被 發(fā)現(xiàn)（在NANOG+或OCT4+食蟹猴細(xì)胞內(nèi)或附近發(fā)現(xiàn)TD+ OCT4+細(xì)胞）（圖 2A）。盡管這些 細(xì)胞表達(dá)OCT4，但只有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)NANOG（圖 S1C），沒(méi)有在這些細(xì)胞中觀察到GATA6 表達(dá)（一種下胚層【HYP】標(biāo)記）（圖 S1C）。 此外，還檢測(cè)到TD+GATA4+ HYP-like細(xì)胞 （圖 2B）。與小鼠中報(bào)道的結(jié)果相反（Yang et al., 2017），在食蟹猴囊胚的滋養(yǎng)外胚層 （TE）層中僅檢測(cè)到少數(shù)iPS1-EPSC表達(dá)了TE標(biāo)記基因（例如TFAP2C和CK7）（圖 2C）。 在d.p.f.11時(shí)，食蟹猴胚胎的EPI層也檢測(cè)到TD+OCT4+細(xì)胞，這些細(xì)胞很少表達(dá)原腸胚形成標(biāo)志物T+（也稱為Brachyury）。相比之下，在胚胎的背側(cè)羊膜處檢測(cè)到T+食蟹猴細(xì)胞（圖 2D）。此外，在食蟹猴HYP細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)表達(dá)HYP標(biāo)志物、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-α （PDGFRα）的TD+人類細(xì)胞（圖 2E）。在EPI層外發(fā)現(xiàn)了表達(dá)COL6A1的OCT4+人類細(xì)胞， COL6A1是胚胎外間充質(zhì)細(xì)胞（EXMC）的標(biāo)志物，表明hEPSC正在向EXMC分化（圖 S1D）。在 d.p.f.13時(shí)，EPI層下方檢測(cè)到hEPSCs并表達(dá)內(nèi)胚層標(biāo)記物SOX17，表明它們已啟動(dòng) 原腸胚形成（圖 2F）。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)從d.p.f.13開始，人類細(xì)胞傾向于聚集在一起并 與食蟹猴EPI層分離，通過(guò)檢測(cè)OTX2和OCT4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些人類細(xì)胞似乎已分化為原腸細(xì) 胞（Martyn et al., 2018; Vincent et al., 2003）（圖 S1E）?？偟膩?lái)說(shuō)，hEPSCs對(duì)EPI的貢獻(xiàn)較高 （在d.p.f.15時(shí)的最高貢獻(xiàn)值為7.08%），對(duì)HYP的貢獻(xiàn)相對(duì)較低（在d.p.f.19時(shí)的最高貢獻(xiàn)為 4.96%）（圖 2G）。

圖2 hEPSCs有助于植入后食蟹猴胚胎中的嵌合體形成

3、人猴嵌合胚胎的轉(zhuǎn)錄圖譜

為進(jìn)一步描繪人猴嵌合胚胎的發(fā)育軌跡，進(jìn)行了scRNA-seq以分析不同發(fā)育階段的人和猴 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。胚胎分離后，使用熒光顯微鏡手動(dòng)收集單個(gè)人類（TD+）和猴（TD-）細(xì)胞并 進(jìn)行scRNA-seq。對(duì)離體培養(yǎng)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)從嵌合胚胎中分離的227個(gè)人的和302個(gè)食蟹猴 的細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序（d.p.f.9-d.p.f.17）。TD表達(dá)和比對(duì)到人類或食蟹猴基因組的reads用于進(jìn)一步確認(rèn)每個(gè)細(xì)胞的來(lái)源物種（圖 S2A 和 S2B）。嚴(yán)格過(guò)濾后，200 個(gè)人的和 272 個(gè)食蟹猴的細(xì) 胞用于進(jìn)一步分析。每個(gè)細(xì)胞平均檢測(cè)到 9,798 個(gè)基因（每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄本【TPM】>0）和 27,936,953條reads，在人和猴細(xì)胞之間檢測(cè)到的基因數(shù)量和reads沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 S2C）。 為進(jìn)行比較，本分析中還選擇了已發(fā)表的食蟹猴和人類胚胎細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)集 （Nakamura et al., 2016; Niu et al., 2019; Xiang et al., 2020; Zhou et al., 2019）。為避免不同數(shù)據(jù) 集的批次影響，本研究使用“錨定”方法去除批次效應(yīng)（Stuart et al., 2019）（圖 S2C）。

圖S2 細(xì)胞物種來(lái)源鑒定和QC

對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了t-SNE分析，確定了所有樣本（嵌合胚胎和對(duì)照胚胎）中存在4個(gè) 主要細(xì)胞cluster：EPI、HYP、TE和EXMC（圖 3A、3B和S2D）。通過(guò)細(xì)胞特異性marker分 析，發(fā)現(xiàn)人和食蟹猴之間存在保守性（圖 S2E）（Zhou et al.,2019）。嵌合胚胎中這些細(xì)胞類 型的存在表明宿主胚胎的發(fā)育基本上不受注射的hEPSCs的影響（Ma et al., 2019; Niu et al.,?2019）（圖 1B 和 1D）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析（基于基因表達(dá)水平）顯示，雖然嵌合胚胎中的大 多數(shù)食蟹猴細(xì)胞分離成不同的細(xì)胞類型特異性簇（EPI、HYP和TE），但嵌合人類HYP-和TE- like 細(xì)胞與 EPI-like 細(xì)胞聚集在一起（圖 3C）。因此，嵌合食蟹猴細(xì)胞比引入的hEPSC表現(xiàn)出 更強(qiáng)的譜系分離。與IF結(jié)果一致，在scRNA-seq數(shù)據(jù)（圖 3A 和 3D）中鑒定到的人類TE-like細(xì) 胞很少，因此被排除在后續(xù)分析之外。這些結(jié)果表明，hEPSCs在被引入食蟹猴早期囊胚并進(jìn) 行離體胚胎培養(yǎng)后，可以分化為幾種植入前和植入后早期細(xì)胞類型。

圖3 人猴嵌合胚胎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

4、hEPSCs在人猴嵌合體發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)

首先基于所有細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特性構(gòu)建了一個(gè)導(dǎo)向圖（SPRING）（Weinreb et al., 2018），所有細(xì)胞分為三個(gè)分支：EPI、HYP和TE（圖 4A），明確了嵌合體和對(duì)照（人和食 蟹猴）胚胎之間基因表達(dá)模式的相關(guān)性（圖 4B）。當(dāng)嵌合人類細(xì)胞與對(duì)照人類（0.460）或?qū)?照食蟹猴（0.459）細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，獲得了類似的相關(guān)系數(shù)（圖 4B，右圖），但與對(duì)照胚胎 相比，嵌合猴細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)高于嵌合人類細(xì)胞（圖 4B，左圖）；接下來(lái)發(fā)現(xiàn)嵌合人EPI-like 細(xì)胞與人胚胎中的EPI細(xì)胞相似，而嵌合人HYP和EXMC-like細(xì)胞分別與嵌合猴HYP和EXMCs 細(xì)胞相關(guān)系數(shù)最高（圖 4C）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)嵌合人類EPI-like細(xì)胞逐漸傾向于嵌合猴EPI細(xì)胞，R2 值從0.363（植入前EPI [Pre_EPI]）增加到0.464（植入后EPI [PostL_EPI]），再增加到0.693 （原腸[Gast]細(xì)胞）（圖 4C）。以上結(jié)果表明猴胚胎微環(huán)境對(duì)人類細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)產(chǎn)生影 響，反之亦然。

圖4 嵌合胚胎的發(fā)育軌跡

由于食蟹猴的細(xì)胞在人類細(xì)胞存在下表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄組的變化，接下來(lái)分析了嵌合胚胎中食蟹 猴細(xì)胞的發(fā)育動(dòng)態(tài)。首先確定了嵌合猴胚胎和對(duì)照猴胚胎之間的差異表達(dá)基因（DEG）。EPI 細(xì)胞、HYP細(xì)胞和EXMCs細(xì)胞與對(duì)照胚胎相比，嵌合體細(xì)胞中分別有424、7和241個(gè)基因下 調(diào)，5、2 和13個(gè)基因上調(diào)（圖 4D 和 S3A）。GO和KEGG富集分析確定了在嵌合猴EPI細(xì)胞、 HYP細(xì)胞和EXMCs細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)基因的信號(hào)通路，如Hippo和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β） 信號(hào)通路分別在嵌合猴EPI細(xì)胞和EXMCs細(xì)胞中下調(diào)（圖 4E）。 已經(jīng)證明食蟹猴EPI細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜在嵌合胚胎中發(fā)生了改變，接下來(lái)研究了食蟹猴EPI胚 胎生態(tài)位是否也受到人類細(xì)胞的影響。CellPhoneDB（v2.0.1）（Vento-Tormo et al., 2018）可 鑒定嵌合胚胎和對(duì)照胚胎中EPI和其他譜系（HYP 和 EXMCs）之間細(xì)胞的潛在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照胚胎相比，嵌合胚胎中有更多的配體-受體相互作用（如，在猴EPI細(xì)胞中檢測(cè)到 117個(gè) [嵌合] 與10個(gè) [對(duì)照] 特異性配體-受體相互作用）（圖 4F 和 S3B）。進(jìn)行KEGG分析發(fā) 現(xiàn)，嵌合胚胎中被加強(qiáng)的信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇 3-激酶 [PI3K]-Akt、絲裂原活化蛋白激酶 [MAPK] 信號(hào)通路和WNT信號(hào)通路（圖 4G）。使用相同的方法，還確定了嵌合胚胎內(nèi)人和猴 細(xì)胞-細(xì)胞的相互作用，如FGF5-FGFR4、NOTCH4-JAG2、WNT2B-FZD4、WISP3-SORL1和 PLXNB2- PTN（圖 S3C 和 S3D）。結(jié)果表明，嵌合胚胎內(nèi)的細(xì)胞間相互作用得到加強(qiáng)，并可 能導(dǎo)致其他信號(hào)通路的激活。

圖S3 嵌合胚胎與宿主胚胎食蟹猴細(xì)胞對(duì)比分析

5、嵌合的人類EPI-like細(xì)胞顯示出獨(dú)特的發(fā)育軌跡

EPI發(fā)展的特點(diǎn)是進(jìn)行多能性轉(zhuǎn)變，可能在物種之間表現(xiàn)出不同的動(dòng)態(tài)。適當(dāng)?shù)腅PI分化對(duì) 于嵌合體的形成和發(fā)育至關(guān)重要，本研究對(duì)嵌合胚胎內(nèi)人類EPI-like細(xì)胞的譜系分化進(jìn)行了研 究，并將其與體外培養(yǎng)的人類和食蟹猴胚胎的數(shù)據(jù)集進(jìn)行了比較（Nakamura et al., 2016; Niu et al., 2019; Zhou et al., 2019），結(jié)果人類EPI-like細(xì)胞在植入前、植入后和原腸胚形成階段被鑒定，并且在每個(gè)階段表達(dá)不同的標(biāo)記物（圖 5A 和 S4A-S4C），桑基圖也顯示了相同的人類EPI- like細(xì)胞發(fā)育軌跡（圖 S4D）。接下來(lái)觀察到hEPSCs更類似于早期PostE_EPI和PostL_EPI細(xì)胞。 嵌合體中人PostL_EPI-like細(xì)胞與制備的PSC的相關(guān)性高于naive PSC（圖 S4E）。為了進(jìn)一步研 究 hEPSC（Yang et al., 2017b）、嵌合體人類 EPI-like細(xì)胞和宿主猴EPI細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)，本研 究進(jìn)行了RNA速度（La Manno et al., 2018）和Slingshot分析（Street et al., 2018）（圖 5B），結(jié) 果發(fā)現(xiàn)兩種不同的RNA速度向量模式：嵌合體人類PostL_EPI-like細(xì)胞向量較長(zhǎng)，而原腸胚細(xì)胞 向量較短；宿主猴PostL_EPI細(xì)胞缺乏長(zhǎng)向量，而原腸細(xì)胞具有長(zhǎng)向量（圖 5B，左邊兩張 圖）。這些結(jié)果表明嵌合人類EPI-like細(xì)胞的發(fā)育延遲。Slingshot分析顯示，hEPSCs在注入食蟹 猴囊胚后，是從EPSCs到PostL_EPI再到原腸胚的發(fā)育軌跡（圖 5B，右圖）。為了進(jìn)一步描繪嵌 合人類EPI-like細(xì)胞的發(fā)育軌跡，將所有與EPI相關(guān)的人類和猴子reads映射到一個(gè)共有基因組， 并使用先前報(bào)道的方法（Kanton et al., 2019）預(yù)測(cè)物種之間EPI的發(fā)育軌跡，與RNA速度分析一 致，發(fā)現(xiàn)嵌合人類EPI-like細(xì)胞比來(lái)自宿主猴、對(duì)照猴和人類胚胎的EPI細(xì)胞分化得更慢（圖 5C）。這些結(jié)果表明，hEPSCs向EPI譜系的特化和/或分化效率低于胚胎細(xì)胞。

圖5 食蟹猴胚胎中嵌合人EPI-like細(xì)胞的發(fā)育軌跡

為了進(jìn)一步描繪嵌合體人類EPI-like細(xì)胞發(fā)育的潛在過(guò)程，本研究繪制了嵌合胚胎內(nèi)的人類 EPI-like細(xì)胞和食蟹猴EPI細(xì)胞、對(duì)照人和猴胚胎的EPI細(xì)胞之間的DEG維恩圖，發(fā)現(xiàn)嵌合體人 EPI-like細(xì)胞和來(lái)自對(duì)照猴胚胎的EPI細(xì)胞之間交集基因315個(gè)（圖 5D），對(duì)這些基因進(jìn)行KEGG 分析，確定了PI3K-Akt、MAPK和過(guò)氧化物酶增殖激活受體（PPAR）信號(hào)通路，表明它們可能 參與人類EPI-like細(xì)胞向食蟹猴EPI細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程（圖 5E和5F）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了許多可能在調(diào) 節(jié)嵌合體人類EPI-like細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因，如CHD2、POLR2A和RB1（圖 S5A 和 S5B）。此外，還發(fā)現(xiàn)大多數(shù)嵌合體人類EPI-like細(xì)胞表達(dá)S/G2/M細(xì)胞周期相關(guān)基因，而嵌合 體和對(duì)照人、猴胚胎細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)水平無(wú)顯著差異（圖 S5C 和 S5E）。Pre_EPI、 PostL_EPI和原腸胚形成細(xì)胞中DEG的GO分析顯示嵌合體人類EPI-like細(xì)胞比正常細(xì)胞分化慢 （圖 S5D）。這些分析揭示了驅(qū)動(dòng)食蟹猴胚胎內(nèi)嵌合體中人EPI-like細(xì)胞的不同譜系分化動(dòng)力學(xué) 相關(guān)的信號(hào)通路和因素。

圖S5 嵌合體EPI細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

結(jié)論

本研究結(jié)果初步證實(shí)了胚胎發(fā)育早期人類和猴細(xì)胞混合時(shí)發(fā)生的細(xì)胞和分子事件，結(jié)果揭示了靈長(zhǎng)類動(dòng)物胚胎發(fā)生過(guò)程中的進(jìn)化趨同和發(fā)散的過(guò)程。這一系列基礎(chǔ)研究將有助于改善進(jìn) 化距離更遠(yuǎn)的物種的人類嵌合現(xiàn)象，出于各種原因，包括社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和倫理，這些物種可能更 適合再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化療法。

本研究局限及后續(xù)研究方向

盡管本研究中使用了相對(duì)大量的食蟹猴胚胎（132），但由于嵌合體實(shí)驗(yàn)固有的隨機(jī)性，并 考慮到可能影響種間嵌合現(xiàn)象的所有因素，后續(xù)需要更大食蟹猴胚胎的數(shù)量進(jìn)行擴(kuò)展分析。因 此本研究的局限性：（1）只測(cè)試了猴胚胎中hEPSC的嵌合能力，沒(méi)有研究人類或其他物種的其 他多能干細(xì)胞，（2）沒(méi)有測(cè)試不同hEPSC數(shù)量對(duì)食蟹猴胚胎的影響，以及（3）無(wú)法測(cè)試不同 的注射階段。因此后續(xù)可針對(duì)本研究的不足，設(shè)計(jì)更大樣本量、更多多能干細(xì)胞種類以及探究 不同多能干細(xì)胞數(shù)量對(duì)嵌合體胚胎的影響，為實(shí)現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化提供更多理論基礎(chǔ)。