文獻(xiàn)解讀 | 單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)繪制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移時空圖譜

百邁客單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA）是在單細(xì)胞水平進(jìn)行高通量基因表達(dá)譜檢測，對復(fù)雜細(xì)胞群深入分析，表征單個細(xì)胞的表達(dá)譜，避免單個細(xì)胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細(xì)胞的均質(zhì)化覆蓋。

空間轉(zhuǎn)錄組（ST）是以高空間分辨率解析RNA-seq數(shù)據(jù)的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)解析單個組織切片中的所有mRNA，從而能夠定位和區(qū)分功能基因在特定組織區(qū)域內(nèi)的活躍表達(dá)信息，對于癌癥、免疫、腫瘤免疫相互作用，組織微環(huán)境，神經(jīng)和發(fā)育等領(lǐng)域，有著令人期待的應(yīng)用前景。

單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)原理對比：

導(dǎo)讀

肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌死亡的主要原因，其免疫微環(huán)境（TME）表現(xiàn)出高度異質(zhì)性。本研究使用單細(xì)胞RNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)對97個配對的樣本進(jìn)行測序。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶免疫微環(huán)境經(jīng)歷了免疫抑制細(xì)胞（如MRC1+ CCL18+ M2樣巨噬細(xì)胞）的空間重編程，并發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的代謝活性。同時，新輔助化療可以阻斷這種狀態(tài)并恢復(fù)患者的抗腫瘤免疫平衡。本研究解析了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞進(jìn)化軌跡，并揭示了腫瘤對新輔助化療的不同反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)方法

材料：癌及癌旁組織樣本
（1）人組織樣本：20名患者（未治療患者n = 11；PD/SD患者n = 5；PR患者n = 4）的89個組織樣本進(jìn)行了scRNA-seq；4名患者（未治療患者n = 2；PR患者n = 2）的組織ST測序；27名患者的104個樣本進(jìn)行mIHC分析（未治療的CRC和癌旁組織n = 17；未治療的LM和癌旁組織n = 18；已治療的PR CRC和癌旁組織n = 9；已治療的PR LM和癌旁組織n = 8）

（2）小鼠組織樣本：4只小鼠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，1只小鼠發(fā)生結(jié)直腸腹膜轉(zhuǎn)移：原發(fā)性腫瘤（n = 4）和轉(zhuǎn)移性腫瘤（n = 5）進(jìn)行scRNA測序
方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、空間轉(zhuǎn)錄組測序、mIHC

研究結(jié)果

1、單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)繪制可切除CRLM中的免疫細(xì)胞多樣性

為了獲得CRLM的單細(xì)胞圖譜，本研究應(yīng)用scRNA-seq和ST來量化CD45+細(xì)胞的動力學(xué)（圖 1A），使用結(jié)直腸癌（CRC）組織及癌旁、肝轉(zhuǎn)移（LM）組織及癌旁，沿結(jié)腸的淋巴結(jié)（LN）組織和外周血單核細(xì)胞（PBMC）。根據(jù)嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共招募24 名可切除的CRLM患者。最終共計(jì)20名患者的89份樣本進(jìn)行了scRNA-seq，4名患者的8份樣本進(jìn)行了ST測序，其中包括未接受治療的13名患者的54份樣本，新輔助化療后PR的6名患者的30份樣本，新輔助化療后PD或SD的5名患者的13份樣本（圖 1A）。所有腫瘤均為微衛(wèi)星穩(wěn)定。

來自未治療患者（n = 11）的79,703個細(xì)胞、來自NAC PD/SD患者（n = 5）的36,284 個細(xì)胞和來自NAC PR患者的62,643個細(xì)胞（n = 4）用于進(jìn)一步分析。每個樣本平均包含2,007個細(xì)胞，每個細(xì)胞中1,064個基因（中位數(shù)），在不同樣本之間沒有明顯的批次效應(yīng)。整合所有178,630個CD45+細(xì)胞，進(jìn)行了聚類分析，并使用SingleR和細(xì)胞marker基因注釋主要細(xì)胞類型。與之前的結(jié)腸癌scRNA-seq基本一致，本研究從CRLM樣本中鑒定到了骨髓細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞（圖 1B、1C）。值得注意的是，不同組織類型的T細(xì)胞比例明顯不同，表明免疫微環(huán)境的組織異質(zhì)性（圖 1D）。CRC和配對LM樣本中所有CD45+細(xì)胞中Treg細(xì)胞約占10%，而這些細(xì)胞在相鄰的正常組織中很少見，這表明腫瘤內(nèi)免疫受到抑制，這之前被歸因于肝轉(zhuǎn)移中免疫治療效果降低。同樣，本研究整合了SingleR和基于marker基因的手動注釋，進(jìn)一步注釋了免疫細(xì)胞亞群（圖 1E）。

本研究分析了來自2名未治療患者和2名NAC PR患者的8個樣本（配對的CRC和 LM）的ST數(shù)據(jù)（圖 1F、1G）。無監(jiān)督聚類分析將樣品分為不同的區(qū)域，例如腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞區(qū)域（圖 1F）。為了整合scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)，本研究使用Seurat來量化主要免疫細(xì)胞亞群。在未經(jīng)處理的樣本中，觀察到與scRNA-seq一致的免疫細(xì)胞模式，例如CD8+T細(xì)胞在LM和CRC中的顯著富集（圖 1G）。相比之下，在NAC處理的樣本中，觀察到較小的腫瘤區(qū)域和免疫細(xì)胞的不規(guī)則分布，特別是在LM中，只有一小部分spot聚集在癌細(xì)胞中，表明NAC治療后細(xì)胞區(qū)室的重塑。總之，結(jié)果突出了CRLM患者的免疫細(xì)胞時空圖譜和NAC后免疫細(xì)胞的重塑。CRLM單細(xì)胞圖譜現(xiàn)已在線提供，用于探索原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位的免疫多樣性（http://www.cancerdiversity.asia/scCRLM）。

圖1 scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示CRLM的免疫細(xì)胞圖譜

2、轉(zhuǎn)移性腫瘤的巨噬細(xì)胞可能轉(zhuǎn)向抑制狀態(tài)

本研究進(jìn)行了基于配體-受體的癌癥-免疫串?dāng)_分析，并在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位之間進(jìn)行比較（圖 2A），發(fā)現(xiàn)SPP1+巨噬細(xì)胞和MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞在LM和CRC之間的差異較大，這一結(jié)果表明肝轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞可能優(yōu)先重編程巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其特定的功能狀態(tài)（圖 2A）。值得注意的是，LM中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)配體CD47，這是一個重要的檢查點(diǎn)，因此可能招募相應(yīng)的受體SIRPA或激活MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞（圖 2B）。進(jìn)一步利用mIHC來可視化這些蛋白質(zhì)，觀察CD47+腫瘤細(xì)胞和SIRPA+巨噬細(xì)胞之間的串?dāng)_（圖 2C）。這些配體-受體對為靶向治療肝轉(zhuǎn)移提供了線索。

對CRC和LM巨噬細(xì)胞進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LM的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞高度表達(dá)了對巨噬細(xì)胞極化至關(guān)重要的廣譜關(guān)鍵分子（圖 2D）。APOE作為抗炎和pro-M2轉(zhuǎn)化蛋白，是顯著差異表達(dá)的基因之一，其他M2極化相關(guān)基因如MARCO在LM的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞中也顯著上調(diào)（圖 2E）。相比之下，CRC的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更高的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，包括TNF、IL1B、CCL3和CCL4。在SPP1+巨噬細(xì)胞中也觀察到這種基因表達(dá)譜的變化，表明巨噬細(xì)胞具有從原發(fā)部位到轉(zhuǎn)移部位的共同功能變化。通路富集分析顯示（圖 2F）CRC和LM的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞在代謝通路中高度富集，證明這些巨噬細(xì)胞在代謝功能中的基本作用。值得注意的是，CRC中的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞富含氧化磷酸化，而它們在LM中則以氨基酸代謝為主。這些數(shù)據(jù)證明，代謝調(diào)節(jié)可能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞響應(yīng)不同的免疫微環(huán)境。

圖2 轉(zhuǎn)移性腫瘤中MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出終末分化和抑制狀態(tài)

3、MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞在肝轉(zhuǎn)移中的代謝活性急劇增加

為了解CRLM中髓樣細(xì)胞的代謝情況，首先計(jì)算了抑制性巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中76種活躍代謝途徑的得分，選擇了前50%的可變代謝評分，并根據(jù)其平均代謝評分對骨髓細(xì)胞（不包括低豐度的骨髓細(xì)胞）進(jìn)行了排名（圖 3B），發(fā)現(xiàn)LM浸潤的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞在所有骨髓細(xì)胞中表現(xiàn)出最高的代謝活動，這可能與它們在轉(zhuǎn)移部位的獨(dú)特功能有關(guān)。通過對MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞的所有代謝相關(guān)基因的進(jìn)一步無監(jiān)督聚類，發(fā)現(xiàn)其與周圍組織較強(qiáng)的代謝偏好（圖 3C），確定了CRC和LM免疫浸潤的MRC1+CCL18+巨噬細(xì)胞中可能上調(diào)的42種代謝途徑。其中，苯丙氨酸代謝有助于產(chǎn)生酪氨酸，在LM的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞中表達(dá)更高。隨后研究了差異表達(dá)的代謝基因，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞中特異性上調(diào)的代謝基因，部分是已知藥物的靶基因（圖 3C）。GSTO1是細(xì)胞色素P450代謝的一種酶，在CRC和LM浸潤的MRC1+CCL18+巨噬細(xì)胞中顯著升高，并與分化相關(guān)（圖 3D 和 3E）。巨噬細(xì)胞激活所必需的基因IL4I1和MIF也顯示出相似的特征（圖 3D 和 3E）。mIHC驗(yàn)證這些代謝酶，觀察到基本一致的結(jié)果（圖 3F）。

接下來構(gòu)建CRLM的小鼠模型（圖 3G）并將scRNA-seq應(yīng)用于原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性腫瘤。結(jié)果在小鼠CRLM模型中發(fā)現(xiàn)了類似的巨噬細(xì)胞亞群，例如Mrc1+巨噬細(xì)胞和Spp1+巨噬細(xì)胞（圖 3H）。沒有觀察到這些巨噬細(xì)胞在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位之間的顯著差異比例，可能是由于原發(fā)腫瘤是在皮下而不是在結(jié)腸中建立的。進(jìn)一步的代謝分析顯示了LM和CRC浸潤巨噬細(xì)胞的特征代謝狀態(tài)（圖 3I）。檢查了前3條差異表達(dá)途徑（小鼠模型中的LM與CRC），其中一些在人和小鼠中是保守的。例如，氧化磷酸化和苯丙氨酸代謝在人和小鼠巨噬細(xì)胞之間是一致的。苯丙氨酸代謝的關(guān)鍵酶Mif的表達(dá)也與人CRLM一致?？傊琇M中的巨噬細(xì)胞代謝活性急劇增加，例如苯丙氨酸代謝。抑制這種代謝活動可能會調(diào)動抗腫瘤免疫反應(yīng)來控制晚期CRC的肝轉(zhuǎn)移。

為了說明代謝重編程與巨噬細(xì)胞表型變化的關(guān)聯(lián)，本研究計(jì)算了巨噬細(xì)胞的經(jīng)典通路評分，例如抗原加工、呈遞、炎癥、血管生成、免疫抑制、吞噬作用、白細(xì)胞介素信號通路和補(bǔ)體評分（圖 3J）。在LM中，MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞的抗原加工和呈遞以及補(bǔ)體活性評分顯著增加（圖 3J），SPP1+巨噬細(xì)胞也顯示出類似的趨勢。某些基因如HLA-A（MHC I類分子之一）在LM的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞中上調(diào)。進(jìn)一步分析了42種腫瘤高代謝途徑與MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞通路評分之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)包括戊糖和葡萄糖醛酸互變在內(nèi)的幾種巨噬細(xì)胞特異性代謝途徑與LM中的抗原加工和呈遞有很強(qiáng)的相關(guān)性，但在CRC的相關(guān)性很弱（圖 3K）。這些數(shù)據(jù)表明不同的代謝功能在MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞表型中的潛在作用。

圖3 轉(zhuǎn)移性腫瘤中的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞顯示出高代謝活性

4、NAC反應(yīng)性和非反應(yīng)性腫瘤具有不同的免疫動力學(xué)

為探索NAC對腫瘤免疫的影響，本研究使用TooManyCells對所有CD45+細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)CRC和LM之間細(xì)胞聚類的顯著差異（圖 4A）。NAC對TME的影響高度依賴于細(xì)胞類型（圖 4B和4C）。通常，在PR中，NAC可以下調(diào)免疫抑制細(xì)胞并激活細(xì)胞毒性細(xì)胞（圖 4B）。在LM中，響應(yīng)性NAC下調(diào)SPP1+巨噬細(xì)胞但上調(diào)細(xì)胞毒性T細(xì)胞，例如GZMK+CD8+ T細(xì)胞和XCL1+CD8+ T細(xì)胞（圖 4B和4D）。NAC-PR中僅剩下幾個MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞和幾十個SPP1+巨噬細(xì)胞，表明NAC在抑制巨噬細(xì)胞中的潛在作用。然而，在PD/SD中，觀察到與PR不同的免疫細(xì)胞變化。例如，SPP1+巨噬細(xì)胞和MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞在LM中增加，而細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞（即FGFBP2+ GZMB+ CD8+ T細(xì)胞）下調(diào)（圖 4C、4E和4F）。這些結(jié)果可能與癌細(xì)胞的器官特異性和治療效果有關(guān)。例如，轉(zhuǎn)移性PD/SD癌細(xì)胞表現(xiàn)出DNA修復(fù)和脂肪酸代謝的特異性富集，而轉(zhuǎn)移性PR癌細(xì)胞與脂肪生成更相關(guān)。除腫瘤組織外，NAC上調(diào)鄰近正常肝臟中GZMB+CD8+ T細(xì)胞的比例，并增加PR患者PBMC中FGFBP2+GZMB+CD8+ T細(xì)胞的比例。對于PD/SD患者，在鄰近結(jié)腸和肝臟中也觀察到FGFBP2+ GZMB+CD8+ T細(xì)胞水平降低?？傊?，有效的NAC不僅重新編程了腫瘤內(nèi)免疫平衡，還激活了全身抗腫瘤免疫反應(yīng)，為支持NAC在可切除CRLM中的潛在作用提供了證據(jù)。

圖4 新輔助化療通過激活細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞和抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤中的免疫抑制細(xì)胞來恢復(fù)免疫平衡

結(jié)論

本研究展示了CRLM的空間和細(xì)胞圖譜，并確定了新輔助化療對TME的功能影響，加深了我們對CRLM免疫生物學(xué)的理解。本研究對發(fā)生轉(zhuǎn)移時激活的代謝途徑進(jìn)行了深入分析，為癌癥轉(zhuǎn)移生物學(xué)研究提供獨(dú)特的見解。

原文鏈接：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34417225