什么是RT-qPCR？& RNA一站式解決方案

什么是RT-qPCR？& RNA一站式解決方案

RT-qPCR包括三大步驟：RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，可以合成cDNA探針、獲取目的基因、以及分析基因的轉(zhuǎn)錄水平。

RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)

從細(xì)胞、組織等樣本中提取出RNA后，需要對(duì)提取的RNA的純度、濃度、以及完整性進(jìn)行評(píng)估，質(zhì)檢達(dá)標(biāo)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。一般需要通過紫外分光光度法（Nanodrop儀器）檢測(cè)RNA的濃度和純度；Agilent 2100儀器分析RIN值檢測(cè)RNA的完整性；以及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA是否有基因組污染和其他雜質(zhì)污染。

1.RNA的濃度&純度檢測(cè)（吸光度法）

由于RNA具有共軛結(jié)構(gòu)，可以吸收紫外光，故測(cè)定RNA溶液在260 nm的吸光度值，可計(jì)算出RNA的含量。其中純度高的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀比值應(yīng)在1.9~2.2之間，若比值＞2.2，表明可能有異硫氰酸，若比值<1.9，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染；建議重新提取RNA。

2.RNA完整性檢測(cè)（Agilent 2100分析）

RIN值大小反映樣品的完整性，一般RIN值在5~10之間，數(shù)值越接近10表明RNA完整性越高，反之RIN值越小完整性越差（特殊樣品需結(jié)合基線綜合評(píng)估）。Agilent 2100檢測(cè)不僅可以得到樣品RIN值，還可以得到樣品濃度以及28S/18S比值（原核生物是23S/16S）。

圖1：RNA完整性指標(biāo)

3.基因組及其他雜質(zhì)污染檢測(cè)（凝膠電泳）

真核生物RNA特有28S、18S、5S三條帶，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)，28S條帶的亮度大概是18S條帶的兩倍或者以上，且無(wú)拖尾，說(shuō)明RNA的完整性高、未被其他雜質(zhì)污染。若出現(xiàn)其他條帶、或者條帶彌散拖尾，建議重新提取RNA。

圖2：真核生物完整的 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

總之，RNA提取的原則：

①　保證RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；

②　不存在對(duì)酶存在抑制作用的有機(jī)溶劑，以及過高濃度的金屬離子污染；

③　其他蛋白質(zhì)、多糖和脂類污染；

④　排除其他核酸分子（DNA、游離核苷酸等）污染。

產(chǎn)品名稱：植物RNA提取試劑盒?Biomarker Plant Total RNA Isolation Kit (Polysaccharides&Polyphenolics–rich)

目錄:?RK02004

規(guī)格:?50 RXN

產(chǎn)品特點(diǎn)：專門針對(duì)多糖多酚或高淀粉植物組織提取RNA

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：RNA提取凝膠電泳圖

圖3：提取50 mg不同組織中的RNA。Lane 1：番茄果；Lane 2：南瓜葉；Lane 3：玉米根；Lane 4：南瓜莖；Lane 5：絲瓜花；Lane 6：水稻種子。

除此之外，百邁客公司還提供動(dòng)物常量RNA提取試劑盒（目錄:RK02009

規(guī)格: 50 RXN，數(shù)據(jù)查看鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/HNp3yFve6AEi3wykngJLlg），可以從細(xì)胞、動(dòng)物組織、幼蟲等樣本中提取純度高的RNA。

以及微量細(xì)胞組織RNA提取試劑盒（目錄:? RK02010 規(guī)格:? 50 RXN，數(shù)據(jù)查看鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/5IYa1MNpQA030OnH_OSeig），可以從~5 mg的細(xì)胞、組織樣本中，快速（20 min內(nèi)）提取純度高的RNA。

逆轉(zhuǎn)錄

cDNA的合成是RT-PCR的重要環(huán)節(jié)。提取完組織或細(xì)胞中的總RNA后，以其中的mRNA作為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)成第一鏈cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，并從中篩選特異的目的基因。該方法已成為基因工程技術(shù)中獲得目的基因的策略之一。

逆轉(zhuǎn)錄PCR重要參數(shù)

不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同；因此，選擇合適的逆轉(zhuǎn)錄酶、二價(jià)陽(yáng)離子、dNTP、引物的選擇等非常重要。具體參數(shù)如下：

1.逆轉(zhuǎn)錄酶

目前市場(chǎng)上有兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄酶，一種來(lái)自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的RNA酶H活性，它最適溫度是42?℃，最適pH 8.3。但是高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度。

另一種來(lái)源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶，是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對(duì)較弱的RNA酶H活性，最適溫度37?℃，最適pH 7.6，較弱的RNA酶H活性，可擴(kuò)增2-3 kb的cDNA。

2.單價(jià)陽(yáng)離子

離子條件基本上影響各種模板的轉(zhuǎn)錄效率。K⁺的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物比Na⁺較長(zhǎng)。對(duì)于cDNA長(zhǎng)度的最適K⁺濃度為140-150 mM。

3.二價(jià)陽(yáng)離子

對(duì)于反轉(zhuǎn)錄酶活性來(lái)說(shuō)，二價(jià)陽(yáng)離子也是必需的。產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA產(chǎn)物的最適濃度是6-10 mM。

4.dNTP

四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)的濃度，對(duì)于有效合成cDNA是至關(guān)重要的。如果其中只有一種的濃度小于10-50?μM，cDNA的產(chǎn)量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-500?μM。

5.引物的選擇

逆轉(zhuǎn)錄引物一般包含三種：oligo dT，Random Primer Mix和特異性引物?？蛻艨梢愿鶕?jù)個(gè)人需求進(jìn)行選擇。

注意事項(xiàng)?

1.cDNA第一鏈合成的反應(yīng)液需要冰上配制。

2.高純度、完整性好的RNA對(duì)于RT-PCR檢測(cè)至關(guān)重要。

3.Oligo-dT引物對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用是常用的，因?yàn)樗_保所有cDNA拷貝終止于mRNA的3′?末端并可獲得最高產(chǎn)量的全長(zhǎng)cDNA。

產(chǎn)品名稱：BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit

目錄:?RK02002

規(guī)格:?100 RXN

產(chǎn)品特點(diǎn)：高反轉(zhuǎn)錄酶的活性、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、可擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)10 kb的cDNA

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的凝膠電泳圖

圖4：以1μl人肝癌細(xì)胞RNA為模板，用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA產(chǎn)物。再以100?ng cDNA為模板，用Biomarker HS 2× HF Master Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果所示：擴(kuò)增條帶單一且產(chǎn)量高。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）是通過檢測(cè)DNA雙鏈結(jié)合的染料，是 SYBR? Green I對(duì)DNA擴(kuò)增過程中的起始量進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)的技術(shù)手段。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果包含擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

1.擴(kuò)增曲線

1）正常的擴(kuò)增曲線一般呈S型、有明顯的四個(gè)時(shí)期，C_t值在20-30之間，且復(fù)孔的C_t值盡量一致，相差不要超過0.5個(gè)C_t值（上限是1個(gè)C_t值）；

2)?同一個(gè)基因在不同濃度的相同模板下擴(kuò)增，其相差的C_t值為相差濃度倍數(shù)的2次方。

3)?另外陰性對(duì)照不能有擴(kuò)增（40個(gè)循環(huán)以后出C_t值屬正常現(xiàn)象，也可算作沒有擴(kuò)增）。

圖5：擴(kuò)增曲線

2.溶解曲線

1）溶解曲線是為了驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，一般是單峰，和模板的濃度無(wú)關(guān)。

2）一般SYBR法的目的基因在80~90?℃之間。

3）若出現(xiàn)其他峰，可能是引物二聚體導(dǎo)致需要優(yōu)化引物序列、引物加量等因素。

圖6：溶解曲線

注意事項(xiàng)

(1) 請(qǐng)確保引物的正確性和特異性。通常引物終濃度0.2 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時(shí)，可以在0.1~1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。

(2) 擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度建議選擇在70~200 bp范圍內(nèi)。

(3) 梯度稀釋模板，并依次建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4) 建議20 μL反應(yīng)體系中加入1 pg~100 ng的DNA為模板，并設(shè)計(jì)無(wú)模板對(duì)照(NTC)。

(5)?為確保實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，建議每個(gè)樣品和對(duì)照組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

產(chǎn)品名稱：Biomarker?2× SYBR Green Fast qPCR Mix

目錄: ?RK02001

規(guī)格: ?500 RXN

產(chǎn)品特點(diǎn)：兼容性完美，全平臺(tái)通用；靈敏度高，可檢測(cè)低至10 pg的模板。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：qPCR擴(kuò)增曲線

圖7：以1?μg不同物種的RNA為模板（紅色：人肝癌細(xì)胞；藍(lán)色：雞；黑色：斑馬魚；紫色：水稻種子；黃色：番茄果），用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA產(chǎn)物。再以100 ng不同物種的?cDNA為模板，用Biomarker?2×SYBR Green Fast qPCR Mix進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

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