文獻(xiàn)名稱：Three-Dimensional Genome Interactions Identify Potential Adipocyte Metabolism-Associated Gene STON1 and Immune-Correlated Gene FSHR at the rs13405728 Locus in Polycystic Ovary Syndrome
期刊：Front Endocrinol (Lausanne)
發(fā)表時間：2021年6月24
原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8264658/
背景
rs13405728 被確定為漢族和高加索女性中最普遍的多囊卵巢綜合征 (PCOS) 易感位點(diǎn)之一。然而，rs13405728 位點(diǎn)的靶基因和潛在機(jī)制仍有待確定。
方法
來自卵巢組織的三維 (3D) 基因組相互作用通過高通染色體構(gòu)象捕獲 (Hi-C) 和捕獲 Hi-C 技術(shù)進(jìn)行表征，以識別 rs13405728 基因座的推定目標(biāo)。對 eQTL、RNA-Seq、DNase-Seq、ChIP-Seq 和單細(xì)胞測序進(jìn)行組合分析，以探索這些靶基因在 PCOS 中的分子作用。應(yīng)用 PCOS 小鼠來驗(yàn)證表達(dá)模式。
結(jié)果
在3D 基因組相互作用與表觀表達(dá)峰中，STON1 和 FSHR 被確定為 rs13405728 基因座的潛在靶標(biāo)，STON1（P=0.0423）和 FSHR（P=0.0013）在 PCOS 患者中高度表達(dá)。STON1 共表達(dá)基因與脂肪細(xì)胞 (P=0.0001) 中的代謝過程 (P=0.0008) 相關(guān)，這在來自脂肪飲食小鼠的脂肪組織 (P<0.0001) 和卵巢 (P=0.0035) 中得到驗(yàn)證。免疫系統(tǒng)過程 (GO:0002376) 富含 FSHR 共表達(dá)基因 (P=0.0002) 和 PCOS 患者 (P=0.0002)，CD4 在 PCOS 患者 (P=0.0316) 和 PCOS 樣模型 (P =0.0079）。同時，在PCOS患者（P=0.0252）和PCOS模型（P=0.0178）中，F(xiàn)SHR表達(dá)與CD4表達(dá)呈正相關(guān)。此外，雄激素受體（AR）被確定為 STON1 和 FSHR 的共同轉(zhuǎn)錄因子，并且與卵巢組織和 PCOS 樣小鼠中 STON1（P=0.039）和 FSHR（P=4e-06）的表達(dá)呈正相關(guān)。
研究內(nèi)容
1、rs13405728 基因座區(qū)域的 Hi-C 圖和表觀基因組峰
文章探索了卵巢組織的 Hi-C 相互作用并在卵巢組織和 GM12878（作為對照）之間進(jìn)行了比較 Hi-C 圖（圖 1A），發(fā)現(xiàn) FOXN2、STON1-GTF2A1L、STON1、GTF2A1L 和 FSHR是 rs13405728 (Chr2:48978158) 基因座的假定目標(biāo)，在卵巢組織中具有相互作用（圖 1B）。
卵巢組織的虛擬 4C 信號用于分析 rs13405728 與靶基因之間的相互作用（圖 1C）。對 H3K36me3、H3K4me1、H3K9me3 和 H3K27ac 的 DNase-Seq、ChIP-Seq 和 mRNA 數(shù)據(jù)進(jìn)行表征，以鑒定卵巢組織的表觀基因組調(diào)節(jié)。文章在 FOXN2、STON1、STON1-GTF2A1L、GTF2A1L 和 FSHR 中發(fā)現(xiàn)了表觀基因組峰和表達(dá)峰（圖 1D）。
圖A Chr2:48478159-49478159 區(qū)域中卵巢組織和 GM12878 之間的比較 Hi-C 圖，標(biāo)記了 rs13405728 基因座。
圖B 來自卵巢組織和 GM12878 的 rs13405728 基因座的相互作用頻率和相互作用。
圖C Chr2:48478159-49478159 區(qū)域中卵巢的虛擬 4C 相互作用。
圖D DNase-Seq、ChIP-Seq（H3K36me3、H3K4me1、H3K9me3 和 H3K27ac）和卵巢的 RNA-Seq 峰。顯示了參考基因和 rs13405728 基因座。Hi-C 高通量染色體構(gòu)象捕獲。
圖1. rs13405728 基因座區(qū)域的 Hi-C 圖和表觀基因組峰
2、rs13405728位點(diǎn)與潛在靶基因的表達(dá)分析
為了進(jìn)一步探索 rs13405728 和靶基因之間的分子模式，文章圍繞來自 12 個組織的 rs13405728 基因座區(qū)域（+/- 10Mb 區(qū)域）進(jìn)行了 Cis-eQTL 分析（圖 2A）。與正常患者相比，文章進(jìn)一步研究了來自 GEO 數(shù)據(jù)集的 PCOS 患者的這些基因是否發(fā)生了變化。 發(fā)現(xiàn) PPP1R21、STON1 和 LHCGR 與 rs13405728 的 SNP 相關(guān)。在來自 GSE145461 數(shù)據(jù)集的 PCOS 中，PCOS 患者中只有 STON1（P = 0.0423）升高，PPP1R21、LHCGR、FOXN2、STON1-GTF2A1L 和 GTF2A1L 不顯著（圖 2B ）。雖然 LHCGR 被認(rèn)為是 rs13405728 位點(diǎn)的靶基因，但在 PCOS 患者中沒有表達(dá)差異。
對卵巢組織的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn) FSHR 在 Cumulus cell_Ube2c 簇（P = 2.3293e-19）、Granulosa cell_Inhba 簇和 Cumulus cell_Car14 簇中高度表達(dá)（圖 2C）。這種表達(dá)模式在小鼠卵巢組織中得到驗(yàn)證（圖 2D）。在患者的卵巢顆粒細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn) PCOS 患者的 FSHR 表達(dá)高于正?；颊?，GSE114419（P = 0.0232）和 GSE138518（P = 0.0013）數(shù)據(jù)集（圖 2E）。此外，我們對卵巢組織中的 STON1、FSHR 和 rs13405728 SNP 進(jìn)行了單組織 eQTL 分析（圖 2F）。
圖A 對來自 12 個組織的 rs13405728 位點(diǎn)區(qū)域（+/- 10Mb 區(qū)域）周圍的潛在靶基因的 Cis-eQTL 分析，顯示了顏色條。
圖B 來自 GSE145461 數(shù)據(jù)集的 PCOS 患者和正常患者的基因表達(dá)。
圖C 來自卵巢單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的卵巢細(xì)胞簇中的 Fshr 表達(dá)。顯示了 14 個集群。
圖D C57BL/6 卵巢組織中 Fshr 的 IHC 染色。
圖E 來自 GSE114419 和 GSE138518 數(shù)據(jù)集的 PCOS 患者和正常患者卵巢顆粒細(xì)胞的 Fshr 表達(dá)。
圖F 來自正常卵巢組織的 rs13405728 位點(diǎn)的 STON1 和 FSHR 的單組織 eQTL 分析。PCOS，多囊卵巢綜合征；eQTL，表達(dá)數(shù)量性狀基因座。
圖2. rs13405728 基因座與潛在靶基因之間的表達(dá)分析
3、STON1 與脂肪細(xì)胞的代謝過程相關(guān)，并在脂肪飲食小鼠的小鼠脂肪和卵巢組織中高度表達(dá)
由于 STON1 在 PCOS 中的生物學(xué)作用尚不清楚，文章在公共數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了 STON1 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，以分析 STON1 在細(xì)胞中的分子功能（圖 3A）。GO 生物過程分析表明 STON1 的共表達(dá)基因與代謝過程 (GO:0008152, P = 0.0008)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生 (P = 0.001) 和定位 (P = 0.007) (圖 3B) 相關(guān)。PaGenBase 中的富集分析表明，網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞特異性富集在脂肪細(xì)胞中（P = 0.0001，圖 3C）。
為了進(jìn)一步探索 STON1 在單細(xì)胞模式中的表達(dá)，文章對 15 個小鼠組織的匯總數(shù)據(jù)進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析。在生殖腺（Cluster5、Cluster6、Cluster13、Cluster21、Cluster38）和基質(zhì)細(xì)胞（Cluster9）中發(fā)現(xiàn)了 STON1（圖 3D 和補(bǔ)充圖 4A、B）。在 GSE135917 數(shù)據(jù)集中，皮下脂肪的 STON1 表達(dá)與體重指數(shù)（BMI，kg/m2）之間的相關(guān)趨勢在男性和女性之間相反（圖 3E）。在 GSE155489 中，PCOS 中 STON1 的表達(dá)高于正常對照（補(bǔ)充圖 4C，P = 0.0391）。重要的是，在脂肪組織（P < 0.0001）和卵巢組織（P = 0.0035）中，脂肪飲食小鼠中 STON1 的 IHC 染色高于正常飲食小鼠（圖 3F、G）。
圖A 顯示了 STON1、共表達(dá)基因和相互作用的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。
圖B STON1 共表達(dá)基因的 GO 富集分析。
圖C 來自 PaGenBase 的 STON1 共表達(dá)基因的細(xì)胞特異性分析。
圖D 來自小鼠單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的合并小鼠組織中 STON1 的 tSNE 圖（Han 等人，2018），STON1 表達(dá)以簇標(biāo)記顯示。
圖E 來自 GSE135917 數(shù)據(jù)集的男性和女性 STON1 表達(dá)與 BMI 之間的相關(guān)性分析。來自脂肪飲食小鼠的脂肪組織和卵巢組織中 STON1 的 IHC 染色 (F) 和染色評分 (G)。GO，基因本體論；tSNE，t-distributed 隨機(jī)鄰居嵌入；BMI，體重指數(shù)；IHC，免疫組織化學(xué)。
圖3. STON1 與脂肪細(xì)胞的代謝過程相關(guān)，并在來自脂肪飲食小鼠的小鼠脂肪和卵巢組織中高度表達(dá)
4、FSHR 與免疫系統(tǒng)過程相關(guān)，并與 PCOS 患者和 PCOS 模型中的 CD4 表達(dá)呈正相關(guān)
為了評估 PCOS 中 FSHR 的分子基礎(chǔ)，文章首先進(jìn)行了 FSHR 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖 4A）。GO富集分析表明，F(xiàn)SHR的共表達(dá)基因與生殖過程（GO：0022414，P = 0.0002）和免疫系統(tǒng)過程（GO：0002376，P = 0.0002）有關(guān)（圖4B）。發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)過程 (GO:0002376, P = 0.0002) 在 PCOS 和正?；颊咧g的卵泡液差異表達(dá)基因 (DEG) 中富集（圖 4C、D）。
據(jù)報道，高雄激素表型是 PCOS 的重要分子機(jī)制，因此對產(chǎn)前雄激素化 (PNA) 小鼠進(jìn)行分析，來分析 PCOS 小鼠與正常對照之間的 DEG（圖 4E）。CD4 等的高表達(dá)在 PCOS 患者（P = 0.0316）和 PCOS 小鼠（P = 0.0079）（圖 4F-H）中均被發(fā)現(xiàn)。 此外，還發(fā)現(xiàn)了 FSHR 與 PCOS 患者（圖 4I）和 PCOS （獼猴）模型（P = 0.0178，r = 0.8889，圖 4J）中的 CD4 表達(dá)呈正相關(guān)（P = 0.0252，r = 0.6967）。
5、AR 被確定為 STON1 和 FSHR 的共同轉(zhuǎn)錄因子，并且與卵巢組織中的 STON1 和 FSHR 表達(dá)呈正相關(guān)
鑒于 PCOS 患者和 PCOS 模型中 STON1 和 FSHR 的表達(dá)增加，文章假設(shè) STON1 和 FSHR 在 PCOS 中的潛在作用，并探討了 PCOS 的高表達(dá)機(jī)制。然后在 rs13405728 基因座區(qū)域（Chr2：48478159-49478159）和 STON1 和 FSHR 的基因區(qū)域（圖 5A-C 和補(bǔ)充表 4-6）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子（TF）分析。AR 是其中唯一的 TF，發(fā)現(xiàn) AR 和 FOXA1 與 STON1 和 FSHR 的 TF 相同（補(bǔ)充圖 5A），STON1 和 FSHR 的進(jìn)一步 ChIP-Seq 分析顯示 AR 在原代組織中的調(diào)制峰（圖 5D， E)。此外，還發(fā)現(xiàn)了AR的表達(dá)與正常卵巢組織中STON1（P = 0.039，r = 0.22）和FSHR（P = 4e-06，r = 0.47）的表達(dá)呈正相關(guān)（圖5F）。與正常小鼠相比，睪酮處理和高脂肪飲食小鼠中 Ar、Fshr 和 STON1 的表達(dá)升高（補(bǔ)充圖 5C），并且它們的表達(dá)呈正相關(guān)（圖 5G）。
rs13405728 基因座區(qū)域的前 20 個轉(zhuǎn)錄因子 (Chr2: 48478159-49478159) (圖A) STON1 (圖B) 和 FSHR (圖C)，調(diào)節(jié)潛力 (RP) 代表評估 TF 調(diào)節(jié)基因的可能性的分?jǐn)?shù) . Y 軸是 RP 分?jǐn)?shù)，X 軸是不同的因素。X 軸上的點(diǎn)代表相同的因素。來自人體組織雄激素受體程序設(shè)計的 STON1 (圖D) 和 FSHR (圖E) 中 AR 的 ChIP-Seq 峰（GSE56288 和 GSE70079）。GTEx數(shù)據(jù)集中卵巢組織中AR和STON1、AR和FSHR（圖F）表達(dá)的相關(guān)性分析。(圖G) 正常小鼠和高脂肪飲食和睪酮處理小鼠中 Ar、Fshr 和 STON1 的 IHC 染色。AR，雄激素受體；GTEx，基因型-組織表達(dá)；H+T、高脂肪飲食和睪酮治療。
圖5. AR 被鑒定為 STON1 和 FSHR 的共同轉(zhuǎn)錄因子，并且與卵巢組織中 STON1 和 FSHR 的表達(dá)呈正相關(guān)
總結(jié)
總體而言，文章將 STON1 和 FSHR 確定為 rs13405728 基因座的潛在靶標(biāo)及其在 PCOS 中脂肪細(xì)胞代謝和 CD4 免疫表達(dá)過程中的作用。
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