2021年8月，百邁客和中國(guó)醫(yī)科大學(xué)合作文章“Identification of Target PTEN-Based miR-425 and miR-576 as Potential Diagnostic and Immunotherapeutic Biomarkers of Colorectal Cancer With Liver Metastasis”發(fā)表于期刊Frontiers in Oncology（IF：6.244）。其中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異及功能分析等使用百邁客云平臺(tái)完成，此外百邁客業(yè)務(wù)還包括單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞ATAC&GEX、單細(xì)胞免疫組庫(kù)等等，有興趣的老師可以聯(lián)系當(dāng)?shù)劁N售。
結(jié)直腸癌（CRC）是最常見(jiàn)和致命的癌癥之一，其主要并發(fā)癥是繼發(fā)性肝轉(zhuǎn)移。這種患者臨床應(yīng)用的生物標(biāo)志物非常少導(dǎo)致該病仍無(wú)法治愈。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與免疫逃逸密切相關(guān)，提示免疫相關(guān)指標(biāo)在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRLM）中的作用過(guò)去可能被忽視。作者揭示了升高的miR-425和miR-576通過(guò)抑制PTEN介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能促進(jìn)CRLM。基于GSE81581和GSE44121數(shù)據(jù)集，相比于原發(fā)性CRC組織miR-425和miR-576在CRLM中顯著上調(diào)。此外，作者還確定了兩個(gè)miRNA參與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的P53和TGF-β信號(hào)通路，均縮短了轉(zhuǎn)移易感性患者的總生存期。值得注意的是對(duì)配對(duì)的CRC組織進(jìn)行原位雜交，不僅證實(shí)了miR-425和miR-576的表達(dá)在CRLM中顯著上調(diào)，而且還揭示了它們與腫瘤惡化尤其是肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，作者進(jìn)一步證實(shí)了miR-425和miR-576聯(lián)合使用是一種有效的肝轉(zhuǎn)移和不良臨床結(jié)局的模型。機(jī)制方面，PTEN下調(diào)被證實(shí)是miR-425和miR-576作為肝轉(zhuǎn)移相關(guān)癌基因的共同靶點(diǎn)，由于在CRLM中存在結(jié)合位點(diǎn)和協(xié)調(diào)抑制P53/TGF-β信號(hào)通路，通過(guò)分子學(xué)實(shí)驗(yàn)在CRC細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)。重要的是靶蛋白PTEN與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、腫瘤微環(huán)境和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)。因此，作者推測(cè)miR-425和miR-576是CRLM預(yù)防和免疫治療的新生物標(biāo)志物，也是PTEN-P53/TGF-β功能軸的上游抑制劑。
英文題目：Identification of Target PTEN-Based miR-425 and miR-576 as Potential Diagnostic and Immunotherapeutic Biomarkers of Colorectal Cancer With Liver Metastasis
中 文 題 目：基于靶蛋白PTEN的miR-425和miR-576作為大腸癌肝轉(zhuǎn)移的潛在診斷和免疫治療標(biāo)志物的鑒定
期 刊：Frontiers in Oncology
IF：6.244
發(fā)表時(shí)間：2021.8
合作單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
研究背景
結(jié)直腸癌是西方第三大常見(jiàn)癌癥也是全球主要的死亡原因。超過(guò)一半的低腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）的CRC患者在診斷時(shí)通常在3年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，這表明迫切需要有效的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估易感性。近年來(lái)，研究CRLM的靶點(diǎn)特別是miRNAs的研究并不缺乏，但能應(yīng)用于臨床實(shí)踐的靶點(diǎn)很少，包括免疫治療，這是一種新興的癌癥治療策略。10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）是一種腫瘤抑制因子，與許多癌癥的惡性進(jìn)展密切相關(guān)如CRLM。值得注意的是近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p共同靶向PTEN，從而促進(jìn)CRLM的發(fā)生。然而，很少有人關(guān)注miR-576-3p與PTEN之間的調(diào)控關(guān)系。
材料方法
試驗(yàn)材料：157例CRC患者癌組織和癌旁組織，其中29例為繼發(fā)性肝轉(zhuǎn)移患者。
試驗(yàn)方法：TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA-seq數(shù)據(jù)、TMA和ISH試驗(yàn)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)、qPCR、WB等。
研究結(jié)果
1、高水平的miR-425和miR-576與CRLM相關(guān)
為了探索促進(jìn)CRLM進(jìn)展的重要miRNA，作者分析了來(lái)自GSE81581 （n = 8）隊(duì)列的數(shù)據(jù)，揭示了CRLM與原發(fā)性結(jié)直腸癌組織之間的miRNA失調(diào)，其中207個(gè)miRNA上調(diào)，20個(gè)miRNA下調(diào)（圖1A）。MiRNA-425和miRNA-576在CRLM中顯著上調(diào)（圖1B）。此外，作者研究了miRNA-425和miRNA-576共同發(fā)揮的轉(zhuǎn)移相關(guān)作用，通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn)P53和TGF-β信號(hào)通路顯著富集（圖1C）。值得注意的是，miR-425和miR-576的高表達(dá)縮短了CD4+或II期直腸腺癌（READ）患者的總生存時(shí)間，這兩者都與CRC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（圖1D）。
為了驗(yàn)證這兩種miRNA的差異表達(dá)，作者收集了157例CRC患者癌組織及癌旁組織。TMA和ISH試驗(yàn)顯示，與對(duì)照相比miR-425和miR-576在CRC患者中高表達(dá)尤其是肝轉(zhuǎn)移患者（圖1E和F）。ROC曲線計(jì)算miR-425和miR-576基于肝轉(zhuǎn)移及其他相關(guān)危險(xiǎn)因素線下面積，初步確定其在CRLM中的可信診斷能力（圖1G）。
圖1高水平的miR-425和miR-576與CRLM相關(guān)
2、miR-425和miR-576表達(dá)與CRLM相關(guān)臨床變量的相關(guān)性
為了探討miR-425和miR-576在CRLM患者中的臨床價(jià)值，作者分析了miR-425和miR-576與環(huán)境因素或病理變量包括年齡、性別、家族史、T分期、樣本量、腸道占位、分化、血管浸潤(rùn)、原發(fā)部位和肝轉(zhuǎn)移。頻率分布和校正后的回歸分析顯示，miR-425和miR-576高表達(dá)均在肝轉(zhuǎn)移患者組織中頻繁分布（圖2A）。此外，miR-425過(guò)表達(dá)與CRC患者晚期T期、腸道占位、分化程度和原發(fā)性直腸相關(guān)（圖2B）。增加miRNA的表達(dá)是滲透到漿膜和廣泛占用腸道的一個(gè)促進(jìn)因素（圖2C）。
MDR分析顯示，miR-425、miR-576與家族病史、分化程度、原發(fā)部位聯(lián)合使用是評(píng)估肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的最佳預(yù)測(cè)模型，其交叉驗(yàn)證一致性（CVC）最高，預(yù)測(cè)誤差最小（表1）。這些結(jié)果提示miR-425和miR-576高水平的CRC患者特別容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。
圖2 miR-425和miR-576表達(dá)與CRLM相關(guān)臨床變量的相關(guān)性
3、miR-425、miR-576表達(dá)對(duì)CRLM患者預(yù)后的影響
總之，系統(tǒng)生存分析顯示，miR-425高表達(dá)的患者總生存期和無(wú)病生存期較差，miR-576高表達(dá)的患者也是如此（圖3A）。結(jié)果首先證明miR-425和miR-576高表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移患者的OS和DFS關(guān)系更為顯著（圖3B）。如預(yù)期，由miR-425和miR-576組成的雙因素模型可以有效預(yù)測(cè)OS狀態(tài)（表2），而miR-425和miR-576的T分期和分化程度是評(píng)估DFS風(fēng)險(xiǎn)的最佳模型（表3）。重要的是，通過(guò)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，作者進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-425和miR-576的組合在晚期CRC和CRLM中是一個(gè)較好的預(yù)后預(yù)測(cè)因子具有較高的敏感性（圖3C-H）。這些結(jié)果表明，高水平的雙miRNA標(biāo)記常常預(yù)示著CRC的預(yù)后不良尤其是CRLM。
圖3 miR-425和miR-576對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的影響
4、PTEN被鑒定為促進(jìn)CRLM的miR-425和miR-576的靶點(diǎn)
為了闡明miR-425和miR-576介導(dǎo)肝轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的有意義的下游靶點(diǎn)，作者在GSE81558 （n = 6）數(shù)據(jù)集上繪制火山圖，分析CRC組織和癌旁組織之間的DEGs（圖4A）。PTEN是CRLM中顯著下調(diào)基因與miR-425和miR-576靶基因的交集（圖4B）。聚類熱圖顯示在CRLM中PTEN的下調(diào)最顯著（圖4C）。進(jìn)一步檢索STRING發(fā)現(xiàn)與PTEN互作的關(guān)鍵蛋白（圖4D）。配對(duì)序列間的有效MFEs分別為?20.8和?16.1 kcal/mol（圖4E）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)PTEN在幾種類型的腫瘤中表達(dá)顯著下調(diào)（圖4F），PTEN表達(dá)越低易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移且預(yù)后越差（圖4G和H）。此外，基于GSE62321 （n = 26）數(shù)據(jù)集，PTEN與miR-425和miR-576一致，證實(shí)PTEN正向參與P53、TGF-β信號(hào)通路，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮有意義的作用（圖4I）。這些結(jié)果表明，PTEN下調(diào)是CRLM中miR-425和miR-576的共同靶點(diǎn)，導(dǎo)致臨床結(jié)果不佳。
圖4 PTEN被鑒定為促進(jìn)CRLM的miR-425和miR-576的靶點(diǎn)
5、miR-425和miR-576通過(guò)抑制PTEN-P53/TGF-b軸對(duì)CRC細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移的影響
接下來(lái)，作者證明了miR-425和miR-576通過(guò)負(fù)調(diào)控PTEN-P53/TGF-β軸，在細(xì)胞學(xué)水平上通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)功能實(shí)驗(yàn)確定了其誘導(dǎo)CRC轉(zhuǎn)移的發(fā)生。QPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在HCT116和SW480細(xì)胞系中，這兩種miRNA的過(guò)表達(dá)均導(dǎo)致PTEN mRNA表達(dá)明顯抑制（圖5A）。MiR-425和miR-576的缺失顯著增強(qiáng)了PTEN mRNA的表達(dá)（圖5B）。WB試驗(yàn)證實(shí)PTEN蛋白的變化一致，P53和TGF-β也是如此（圖5C和D）。正如預(yù)期的那樣，結(jié)果顯示miR-425和miR-576顯著抑制WT熒光素酶基因表達(dá)強(qiáng)度，然而在Mut基因上沒(méi)有觀察到明顯的變化表明PTEN 3’UTR與miR-425和miR-576之間存在直接的結(jié)合模式（圖5E）。此外miR-425和miR-576的高表達(dá)顯著促進(jìn)了HCT116和SW480細(xì)胞的遷移能力分，反之亦然（圖5F-I）。綜上所述，miR-425和miR-576直接靶向PTEN介導(dǎo)的P53/TGF-β信號(hào)通路，參與了CRLM過(guò)程中細(xì)胞遷移的促進(jìn)。
圖5 miR-425和miR-576通過(guò)抑制PTEN-P53/TGF-β軸對(duì)CRC細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移的影響
6、CRLM中miR-425/miR-576-PTEN軸的免疫分析
為了進(jìn)一步研究miR-425和miR-576在CRLM發(fā)生和發(fā)育的免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，作者首先分析了miR-425和miR-576與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。因此，miR-425在CRC進(jìn)展中與免疫檢測(cè)點(diǎn)密切相關(guān)，如CD160、CD200R1和CD80及免疫通路包括CD65自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞（圖6A）。MiR-425與檢測(cè)點(diǎn)和通路存在顯著相關(guān)性（圖6B）。此外，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制因子PTEN與MSI、TME、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，從免疫的角度闡明了PTEN對(duì)CRLM的調(diào)控作用（圖6C-E）。以上結(jié)果表明，miR-425/ miR-576介導(dǎo)的PTEN抑制通過(guò)觸發(fā)免疫逃逸促進(jìn)CRLM過(guò)程。
圖6 miR-425/miR-576和PTEN對(duì)CRLM的免疫分析
研究結(jié)論
綜上所述，miR-425和miR-576的升高與腫瘤發(fā)生和更壞的結(jié)果有關(guān)，并負(fù)向參與了CRLM中PTEN-P53/ TGF-β免疫功能軸。因此，作者的工作有助于更好地了解miRNA-mRNA的潛在應(yīng)用，為在CRLM預(yù)防和免疫治療中尋找潛在的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)提供即時(shí)線索。
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