基因組（Denovo sequencing），即基因組從頭測(cè)序，指在不依賴參考基因組的情況下繪制該物種的全基因組序列圖譜，從而獲取該物種的全部遺傳信息。高連續(xù)性基因組的獲得，對(duì)后續(xù)功能基因定位，結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)具有重要的意義。結(jié)合近幾年的文章我們不難發(fā)現(xiàn)，基因組研究主要以下面幾種方向?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn)開(kāi)展：
1）大型/多倍體/超復(fù)雜物種基因組破譯，技術(shù)創(chuàng)新改革；
2）0 Gap基因組/單體型基因組構(gòu)建，序列優(yōu)化打磨；
3）未知基因組破譯聯(lián)合多組學(xué)分析，經(jīng)濟(jì)價(jià)值挖掘；
4）品種泛基因組構(gòu)建解析功能變異，覆蓋多樣表型；
5）科屬水平譜系基因組構(gòu)建與分析，探索進(jìn)化功能；
6）多種基因組聯(lián)合多組學(xué)比對(duì)剖析，解析性狀特征。 … …
前5種好理解，第6種方向能做什么呢？其實(shí)我們想要了解一個(gè)物種，往往單一基因組難以完整解析，例如該物種不同性別如何引起性狀差異？性別決定基因在哪里？例如表型明顯差異的種質(zhì)間的基因有哪些異同？例如兩個(gè)物種表型相似但分類水平卻存在爭(zhēng)議？例如多倍體物種的演化歷程模糊？等等棘手但是卻又熱門(mén)的研究話題。
接下來(lái)小編將通過(guò)百邁客最近三篇?jiǎng)又参锷系某晒Π咐龓Т蠹铱纯?，如何通過(guò)數(shù)個(gè)材料基因組結(jié)合多組學(xué)的手段解析性狀特征。
案例一
合作單位：中科院南海海洋研究所
發(fā)表期刊：Science Advances
影響因子：14.131
發(fā)表時(shí)間：2021.08
研究材料：
Denovo: 雌性與雄性草海龍（Phyllopteryx taeniolatus）；雌性與雄性綠海龍（Syngnathoides biaculeatus）
個(gè)體重測(cè)序：2只雄性草海龍
RNA-seq：腦、眼、鰓、肝、腸、肌肉、鰭、皮膚和附葉
測(cè)序方案
Denovo：雌性、雄性草海龍與雄性綠海龍PacBio平臺(tái)；雌性綠海龍Nanopore平臺(tái)，雌性、雄性草海龍與雄性綠海龍進(jìn)行Hi-C測(cè)序。三代測(cè)序技術(shù)對(duì)應(yīng)測(cè)序數(shù)據(jù)如下表所示：
個(gè)體重測(cè)序：~30X PacBio
研究?jī)?nèi)容
1.兩種海龍基因組組裝與進(jìn)化關(guān)系
草海龍最終組裝大小為 ~659 Mb（♂）與 ~663 Mb（♀）, contig N50分別為10.0 Mb與12.1 Mb。綠海龍分別組裝~637 Mb（♂）與~648 Mb（♀），contig N50分別為18.0Mb與21.0 Mb。4個(gè)基因組BUSCO評(píng)估顯示范圍在94.00- 94.40%。并分別在草海龍和綠海龍中確定了31個(gè)和33個(gè)發(fā)生擴(kuò)張的基因家族。通過(guò)19條鰭魚(yú)類全基因組數(shù)據(jù)集進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，明確草海龍與綠海龍?jiān)谙到y(tǒng)發(fā)育地位上屬于海龍亞科（Syngnathinae）的姊妹群，并于27.3 百萬(wàn)年前左右發(fā)生分化。
2.“附葉”相關(guān)基因研究
草海龍的頭部、頸部、腹部、背部和尾部區(qū)域有葉子狀的附屬物，可以與周圍環(huán)境相融合，使草海龍以完美擬態(tài)隱匿于海草床中。這些結(jié)構(gòu)是該物種的一種適應(yīng)性進(jìn)化產(chǎn)物，主要由骨基質(zhì)和富含膠原纖維的結(jié)締組織組成。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)基因（如msx, dlx, fgf）主要從皮膚和鰭等器官募集而來(lái)，暗示了相關(guān)基因?qū)π缕鞴佼a(chǎn)生和維持的重要作用。而“附葉”與鰭相比缺乏肢體發(fā)育特異性的hox基因。草海龍的附葉在捕食者的襲擊中經(jīng)常受到損傷，為了研究相關(guān)機(jī)制，作者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析研究發(fā)現(xiàn)在其附葉中炎癥和損傷修復(fù)相關(guān)基因表現(xiàn)出高表達(dá)水平，說(shuō)明這些基因可能與其附葉的快速愈合和再生能力相關(guān)。同時(shí)草海龍?zhí)禺愋詳U(kuò)張的MHC I基因也在附葉中顯著高表達(dá)，能為其提供額外的免疫保護(hù)。
圖1 草海龍附葉形態(tài)及關(guān)鍵基因表達(dá)特征
3.性別決定位點(diǎn)分析
通過(guò)雄性和雌性葉海龍Illumina reads正反比對(duì)雄性和雌性的全基因組序列，來(lái)確定葉海龍中假定的性染色體和性別基因座。結(jié)果顯示Chr4上的一個(gè)~47-kb區(qū)域僅在雄性中存在， 且reads覆蓋度為Chr4平均值的一半，該片段經(jīng)Hi-C互作分析結(jié)果支持。注釋及比較分析發(fā)現(xiàn)草海龍和綠海龍的性別決定基因均為amhr2的雄性特異性拷貝amhr2y，但兩者的基因座不相同。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，amhr2y起源于它們最近共同祖先的重復(fù)事件，而黃鱸amhr2y是從其譜系中的獨(dú)立重復(fù)事件進(jìn)化而來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)amhr2y比amhr2受到的選擇壓力更強(qiáng)，其整體結(jié)構(gòu)與amhr2相似。
圖2 草海龍與綠海龍性別決定基因進(jìn)化
4.無(wú)牙研究
草海龍與其他海龍科物種一樣具有缺乏牙齒的管狀吻。研究表明，大部分富含 P/Q 的分泌型鈣結(jié)合磷蛋白（SCPP）基因的缺失可能是導(dǎo)致syngnathids無(wú)牙的原因。為了驗(yàn)證海龍科中因假基因化喪失功能這一點(diǎn)，作者使用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了兩個(gè)斑馬魚(yú)scpp5突變系，發(fā)現(xiàn)scpp5-/-突變體斑馬魚(yú)牙齒的數(shù)量減少且頜骨中存在用于附著牙齒的凹坑。
研究結(jié)論
該研究通過(guò)雌雄性海龍基因組的破譯，結(jié)合重測(cè)序分析、轉(zhuǎn)錄分析、比較基因組分析等研究揭示了海龍科物種性別決定基因的產(chǎn)生和演化歷程，為海洋魚(yú)類的環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化研究提供了重要理論依據(jù)。
案例二
合作單位：浙江大學(xué)
發(fā)表期刊：Plant Biotechnology Journal
影響因子：9.801
發(fā)表時(shí)間：2021.08
研究材料：
Denovo：Brassica juncea菜用芥菜T84-66、油用芥菜AU213；
個(gè)體重測(cè)序：12個(gè)油菜品種；
遺傳進(jìn)化：183份油用與菜用芥菜；
測(cè)序方案
Denovo：菜用芥菜分別146 Gb Illumina（~150X）+ 251 Gb PacBio（~200X）+Hi-C(~200X )；油用芥菜147 Gb Illumina（~150X）+205 Gb PacBio（~200X）+Hi-C(~200X )
個(gè)體重測(cè)序：~20X Nanopore
遺傳進(jìn)化與GWAS：~10X illumina
研究?jī)?nèi)容
1.菜用芥菜T84-66與油用芥菜AU213基因組Denovo
本研究在首次完成榨菜基因組組裝基礎(chǔ)上（Nature Genetics，2016 【項(xiàng)目文章】NG芥菜基因組文章解讀），進(jìn)一步優(yōu)化與解析低硫苷油用芥菜變種AU213的染色體水平基因組。調(diào)研圖評(píng)估菜用與油用芥菜大小結(jié)果分別為968 Mb與938 Mb，且contigN50分別為3.36 Mb及4.4 Mb，*大的scaffold近乎跨越了完整的染色體序列。T84-66與AU213基因組BUSCO（97.7 %與98.3%）、CEGMA（99.6 %與99.8 %）、二代數(shù)據(jù)回比（97.12 %與96.18 %）、GOGGs驗(yàn)證以及與前期基因組版本比較等方式，共同表明本次基因組組裝的高完整性。兩種芥菜中分別預(yù)測(cè)了100,829及100,048個(gè)基因，與16年已發(fā)表的 T84-66 (V1) 版本相比有所增加。芥菜型油菜的Hi-C圖譜顯示常染色質(zhì)（A）和異染色質(zhì)（B）的分布對(duì)比顯示，在著絲粒附近的異染色質(zhì)狀態(tài)中具有相對(duì)較低的基因表達(dá)模式。
圖1 芥菜表型與基因組特征以及三維基因特征
2.結(jié)構(gòu)變異研究
系統(tǒng)地鑒定了T84-66 和 AU213 的A和B亞基因組中的全基因組單核苷酸多態(tài)性 (SNP)、插入/缺失 (InDels)和存在/缺失變異(PAV)。在T84-66和AU213之間的A和B亞基因組中鑒定了24,768個(gè)PAV（> 100 bp），其中3,634個(gè)PAV導(dǎo)致6,425個(gè)基因的變異。隨機(jī)選擇了幾個(gè)PAV并使用PCR來(lái)確保這些PAV的保真度。其中一些基因組變異位于基因區(qū)域內(nèi)，預(yù)計(jì)會(huì)影響T84-66和AU213作物中涉及生物和非生物脅迫的基因功能。
為了破譯芥菜基因組菜用和油用品種之間SVs衍生的功能差異，作者基于Nanopore重測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)比較了菜用和油用芥菜群體基因組結(jié)構(gòu)變異（structural variation，SV），挖掘到包括1, 354個(gè)高可信度的插入、缺失、重復(fù)、倒位、易位等變異。其中兩個(gè)重要的基因位點(diǎn)TGA1和HSP20在ChrA06和ChrB08，可能與B.juncea基因組的菜用與油用品種之間對(duì)生物和生物應(yīng)力的反應(yīng)的自然變異有關(guān)。這些變異研究為菜用芥和油用芥兩個(gè)典型分化群體的演化提供了基因組變異基礎(chǔ)。
3.群體進(jìn)化與GWAS分析
使用T84-66作為參考基因組，對(duì)183份油用與菜用芥菜進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，并通過(guò)SGS-GWAS（scored genomic SNPs based GWAS）基因定位，在A02和A09中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)參與控制芥菜硫苷（GSL）積累變異的關(guān)鍵遺傳位，并首次發(fā)現(xiàn)A09中的MYB28與B. jucnea中GSL的積累有關(guān)。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究并同過(guò)ONT驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，MYB28基因的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）是導(dǎo)致芥菜種群中硫苷積累差異的原因，該基因的拷貝數(shù)變異在低硫苷芥菜群體中普遍存在。
研究小結(jié)
該研究將為多倍基因組進(jìn)化研究和√確基因組選擇研究提供重要研究信息，對(duì)芥菜風(fēng)味品質(zhì)和油脂質(zhì)量的分子遺傳改良具有重要科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。
案例三
合作單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
發(fā)表期刊：Molecular Biology And Evolution
影響因子：16.241
發(fā)表時(shí)間：2021.05
研究材料：
基因組、Hi-C：圓葉棉G. rotundifolium(K2) 、亞洲棉G. arboreum(A2)、雷蒙德氏棉G. raimondii(D2)新鮮葉片
測(cè)序方案
denovo：illumina K2、A2和D5分別 108×, 118×, 132×；Nanopore K2、A2和D5分別124×, 131×, 167×
Hi-C掛載：6堿基酶HindⅢ；K2、A2和D5分辨率分別為20kb、20kb、10kb
Hi-C互作：4堿基酶DpnⅡ；分辨率20 Kb, 50 Kb, 100 Kb
研究?jī)?nèi)容
1.圓葉棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉基因組組裝注釋
利用Nanopore測(cè)序技術(shù)組裝了圓葉棉（K2）基因組，組裝大小為2.44Gb(contigN50 = 5.33 Mb)；提升了亞洲棉（A2）和雷蒙德氏棉（D5）的基因組，組裝大小分別為1.62 Gb (contigN50 = 11.69 Mb)和0.75 Gb(contigN50 =17.04 Mb )。Hi-C掛載率均超過(guò)99%，BUSCO結(jié)果分別為 92.5%, 93.9%,及95.4%。
重復(fù)序列注釋表明，相對(duì)于D5，K2和A2中棉種特異的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增是造成這三個(gè)基因組大小三倍變化的原因, 特別是Gypsy和DIRS類型。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)座子插入時(shí)間分析表明K2基因組中轉(zhuǎn)座子插入*古老，A2基因組有更多新的轉(zhuǎn)座子。
圖1 圓葉棉基因組組裝特征
2.比較基因組學(xué)和進(jìn)化
比較基因組分析表明，A2和K2基因組在Chr01與Chr02染色體間存在一個(gè)大的易位；K2和D5基因組在Chr13與Chr05染色體間存在一個(gè)大的易位。三個(gè)棉種在57-71 百萬(wàn)年前存在一次共同的全基因組復(fù)制事件，并在5.1-5.4百萬(wàn)年前發(fā)生物種分化，基因共線性分析表明每個(gè)基因組大約有15%特異的基因家族。
3.A/B compartment演化
通過(guò)HiC染色質(zhì)互作數(shù)據(jù)揭示三個(gè)棉種染色體大小的規(guī)律，A2與K2比D5多了約7000個(gè)基因，三個(gè)基因組中17%的共線性同源基因表現(xiàn)為A/B區(qū)室的染色質(zhì)狀態(tài)改變，這與活躍的轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增相關(guān)。
K2與A2及與D5相比更多的傾向于A向B的轉(zhuǎn)化。K2和A2中有更多的基因處于A compartment，D5中有更多的基因處于B compartment。
4.TAD結(jié)構(gòu)演化及轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增對(duì)TAD結(jié)構(gòu)影響研究
大約60%的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域（TAD）在三個(gè)基因組中發(fā)生了重新組織，K2基因組中有更多特異的TAD?；谶吔鏣E覆蓋度，邊界TE表達(dá)以及TE插入時(shí)間分析，發(fā)現(xiàn)K2不保守的TAD邊界存在特異的和較新的轉(zhuǎn)座子（物種分化后爆發(fā)的TE）插入。這些結(jié)果表明最近在K2和A2基因組中表達(dá)的TEs的擴(kuò)增可能有助于在三個(gè)物種分化后形成譜系特異性TAD邊界。基于這些結(jié)果，作者提出了三個(gè)棉種分化過(guò)程中，基因組擴(kuò)張-轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增介導(dǎo)的A/B 區(qū)室轉(zhuǎn)換和TAD重組的進(jìn)化模型。
圖2 三種棉TAD特征
研究小結(jié)
本次研究首次公布了棉屬中二倍體圓葉棉基因組，并對(duì)亞洲棉和雷蒙德氏棉基因組進(jìn)行了升級(jí)，解析了轉(zhuǎn)座子活動(dòng)驅(qū)動(dòng)的基因組大小進(jìn)化特征，從轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增和染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)角度為棉花物種進(jìn)化提供新的見(jiàn)解，為植物中轉(zhuǎn)座子活動(dòng)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)化研究提供參考。
百邁客2021年基因組成功案例展示
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