【成功案例】Insm1的SNAG 域調(diào)節(jié)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化并抑制 β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為δ細(xì)胞

2021年5月，百邁客和暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院合作的文章“The SNAG Domain of Insm1 Regulates Pancreatic Endocrine Cell Differentiation and Represses β- to δ-Cell Transdifferentiation”見(jiàn)刊啦！發(fā)表在《Diabetes》（IF=9.464）。今天小編帶大家一起解讀一下該文章，看看具體做了些什么研究！

本文轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由百邁客協(xié)助完成。百邁客轉(zhuǎn)錄調(diào)控產(chǎn)品不僅有本文所用的二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)品，還有Nanopore三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序哦！在對(duì)基因和轉(zhuǎn)錄組開(kāi)展定量研究的同時(shí)，可以關(guān)注基因結(jié)構(gòu)的分析，包括可變剪切、APA、融合基因等等。同時(shí)還承接Direct RNA測(cè)序，在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，看看RNA修飾也是真真好的呢！感興趣的老師，可以留言或者直接聯(lián)系當(dāng)?shù)劁N售咨詢。

英文題目：The SNAG Domain of Insm1 Regulates Pancreatic Endocrine Cell Differentiation and Represses β- to δ-Cell Transdifferentiation

中文題目：Insm1 的 SNAG 域調(diào)節(jié)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化并抑制β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為δ細(xì)胞

發(fā)表雜志：Diabetes

影響因子：9.464

發(fā)表時(shí)間：2021年5月

合作單位：暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院

胰腺內(nèi)分泌系統(tǒng)受轉(zhuǎn)錄因子的嚴(yán)格調(diào)控，系統(tǒng)失調(diào)引起各種代謝疾病的發(fā)生，包括糖尿病。胰島素瘤相關(guān)蛋白 1 ( Insm1)編碼一種包含有一個(gè) SNAG 結(jié)構(gòu)域和五個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，并在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化和成熟 β 細(xì)胞功能中起重要作用。

在本研究中，比較了 Insm1 null 和 Insm1 SNAG 域突變體 (Insm1delSNAG) 之間胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的分化，以研究Insm1 SNAG 域的特定功能。結(jié)果表明與對(duì)照小鼠相比，Insm1delSNAG 中δ細(xì)胞數(shù)量增加，而Insm1 null突變體中卻沒(méi)有增加；同時(shí)Insm1delSNAG 中β細(xì)胞數(shù)量的減少不像在Insm1 null突變體中那樣嚴(yán)重。此外，在 Insm1delSNAG 和 Insm1 null突變體的α-、PP（胰多肽）和ε細(xì)胞中觀察到類似的細(xì)胞數(shù)減少現(xiàn)象。本研究進(jìn)一步明確δ細(xì)胞數(shù)量的增加是因?yàn)棣录?xì)胞轉(zhuǎn)分化為δ細(xì)胞。從機(jī)制上來(lái)說(shuō)，Insm1 的 SNAG 結(jié)構(gòu)域與 Lsd1（H3K4me1/2 的去甲基化酶）相互作用。Insm1 的 SNAG域中的突變導(dǎo)致 Lsd1 的募集受損，并增加了與 Insm1 結(jié)合的造血表達(dá)同源盒（Hhex）位點(diǎn)中H3K4me1/2的水平，從而提升δ細(xì)胞特異性基因Hhex的轉(zhuǎn)錄活性。本研究已經(jīng)確定了Insm1的SNAG域在調(diào)節(jié)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化中的新功能，特別是在抑制β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為δ細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

材料：Insm1delSNAG突變小鼠（Insm1delSNAG/lacZ)），Insm1非突變小鼠(Insm1lacZ/lacZ)；雜合對(duì)照小鼠（Insm1+/lacZ)。β細(xì)胞敲除小鼠(InsCre;Insm1f/delSNAG; CKO)，Cre雜合對(duì)照小鼠(InsCre;Insm1f/+)；Cre對(duì)照小鼠(InsCre;Insm1+/+)

RNA-seq樣本：取E18.5時(shí)胰腺，每種基因型4個(gè)重復(fù)：Insm1+/lacZ (control),Insm1lacZ/lacZ (Insm1 null), 和Insm1delSNAG/lacZ (Insm1del-SNAG)。

實(shí)驗(yàn)技術(shù)： 免疫熒光分析，RNA-seq（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由百邁客協(xié)助完成），免疫沉淀、WB和ChIP-PCR驗(yàn)證。

測(cè)序平臺(tái)： Illumina NovaSeq 6000

文章結(jié)果

1、Insm1 SNAG域改變了突變小鼠胰腺內(nèi)分泌系統(tǒng)的分化

本研究的目的是確定Insm1的SNAG域在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的發(fā)育中的特異功能。特別是分析了Insm1delSNAG/lacZ(Insm1delSNA突變體)，Insm1lacZ/lacZ (Insm1 null突變體)和Insm1+/lacZ(對(duì)照) 同窩出生小鼠胚胎的免疫熒光。

通過(guò)β-gal（lacZ等位基因的表達(dá)）染色，觀察到Insm1delSNAG突變體的胰腺在E18.5時(shí)胰島素陽(yáng)性β細(xì)胞數(shù)量減少，但是沒(méi)有像Insm1 null突變小鼠中那么嚴(yán)重（圖1A–A”’）。與對(duì)照相比，在Insm1delSNAG或Insm1中沒(méi)有觀察到α細(xì)胞數(shù)有變化（圖1B）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)和對(duì)照相比，在Insm1delSNAG和Insm1-null突變體中觀察到PP數(shù)量的增加和δ細(xì)胞的減少（圖1D和E）。然而與對(duì)照小鼠相比，Insm1delSNAG突變體中生長(zhǎng)抑素陽(yáng)性的δ細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且在Insm1-null突變體中細(xì)胞數(shù)減少了（圖1C–C”）。

圖1.Insm1delSANG突變小鼠在E18.5時(shí)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化受損

為了確認(rèn)這些減少現(xiàn)象是否發(fā)生在早期發(fā)育階段（即E15.5），檢測(cè)了胰腺E15.5的內(nèi)分泌系統(tǒng)。結(jié)果與對(duì)照相比，Insm1delSNAG和Insm1-null突變體中在觀察到一個(gè)類似的減少現(xiàn)象，包括胰島素，胰高血糖素，PP-和饑餓素陽(yáng)性細(xì)胞（圖2）。然而，生長(zhǎng)抑素陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量在Insm1delSNAG或Insm1-null突變體中都沒(méi)有發(fā)生改變（圖2C–C”）。因此，Insm1delSNAG突變體中δ細(xì)胞數(shù)量的增加發(fā)生在E18.5，而不在E15.5。

圖2.Insm1delSANG突變小鼠在E15.5時(shí)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化受損

接下來(lái)研究了Insm1delSNAG突變體中的胰島特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。將野生型和雜合子作為對(duì)照，檢測(cè)與Insm1結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子SMAFA、MafB、Pdx1、Pax6、Ngn3和Isl1/2（圖3和4）。在E18.5（圖3A–C）和E15.5（圖4A–C）時(shí)，與野生型或者雜合對(duì)照相比，Insm1delSNAG突變體的胰島中MafA和MafB表達(dá)顯著降低，Pdx1表達(dá)輕度下降。Pax6的表達(dá)在E18.5時(shí)降低，但是在E15.5時(shí)只有輕微變化（圖3D和圖4D）。Isl1/2和內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞標(biāo)記物Ngn3在兩個(gè)階段均無(wú)變化（圖3E、F和4E、F）。因此，Insm1delSNAG突變導(dǎo)致α-和β-特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)降低，而不是前體細(xì)胞或泛胰島因子。

圖3. E18.5時(shí)胰島特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

圖4. E15.5時(shí)胰島特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

2、Insm1delSNAG突變體的胰腺中的基因表達(dá)

選用E18.5時(shí)Insm1delSNAG，Insm1 null和對(duì)照組小鼠的胰腺，利用RNA-seq研究Insm1delSNAG突變體胰臟內(nèi)的特異性基因表達(dá)。分析發(fā)現(xiàn)在Insm1delSNAG突變體胰腺中，共有231個(gè)基因顯著失調(diào)，這些基因涉及發(fā)育和激素分泌方面。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Insm1delSNAG和null 突變有顯著的差異基因交集，尤其是編碼激素的基因和與葡萄糖代謝和分泌調(diào)節(jié)相關(guān)的基因(圖5A、B)。Insm1delSNAG突變體中大約72.7%的差異基因也在Insm1 null突變體中被檢測(cè)到。然而與Insm1delSNAG突變體相比,Insm1 null突變體中有著更多的基因表達(dá)和數(shù)量上的變化。這些結(jié)果與在Insm1delSNAG突變體中發(fā)現(xiàn)比Insm1null突變體中β細(xì)胞更少這一現(xiàn)象一致。

對(duì)比對(duì)照組或Insm1 null突變小鼠，在Insm1delSNAG突變小鼠中δ細(xì)胞特異性基因生長(zhǎng)抑素(Sst)、Hhex和視黃醇結(jié)合蛋白4 (Rbp4)基因在胰腺中上調(diào)(圖5C)。這與免疫染色觀察到δ細(xì)胞數(shù)量的增加這一發(fā)現(xiàn)一致。大多數(shù)失調(diào)基因已通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR被驗(yàn)證(圖5D)。

圖5.InsmdelSNAG突變小鼠胰腺的基因表達(dá)

3、β細(xì)胞向δ細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化

前面數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)Insm1delSNAG突變體在E15.5之后δ細(xì)胞數(shù)量增加（圖1C和2C），為了驗(yàn)證細(xì)胞數(shù)的增加是否是δ細(xì)胞增殖促成的，該研究在E15.5和E18.5時(shí)的Insm1delSNAG突變小鼠中進(jìn)行了Ki67和生長(zhǎng)抑素的共染色。在δ細(xì)胞中觀察到類似的增殖率，增殖率通過(guò)對(duì)照和Insm1 null或Insm1delSNAG突變體中Ki67+Sst+/Sst+的比值來(lái)表示。同時(shí)也檢測(cè)了Insm1delSNAG突變體中δ細(xì)胞低凋亡率的可能性，是否是導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量差異的原因。然而Insm1delSNAG、Insm1 null突變體和對(duì)照小鼠中生長(zhǎng)抑素陽(yáng)性細(xì)胞率極低，并無(wú)差異。

生長(zhǎng)抑素和胰島素或胰高血糖素的復(fù)合染色很少被觀察到，且在Insm1delSNAG突變體和對(duì)照小鼠之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異。但是在E15.5和E18.5時(shí)Insm1delSNAG突變體中，檢測(cè)到Sst和β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx6.1的復(fù)合染色信號(hào)增強(qiáng)(圖6A、B)。Sst與Nkx6.1的共表達(dá)表明Insm1delSNAG中δ細(xì)胞有可能會(huì)從β細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)。

因此，使用了InsCre;Insm1delSNAG/flox (CKO)小鼠研究動(dòng)物模型中δ細(xì)胞的數(shù)量是否增加，并帶有β細(xì)胞特異性SNAG突變。在新生CKO小鼠的胰腺中觀察到δ細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖7A)。說(shuō)明具有β細(xì)胞特異性的Insm1delSNAG突變導(dǎo)致δ細(xì)胞數(shù)增加。進(jìn)一步使用具有β細(xì)胞特異性小鼠模型mTmG;InsCre;Insm1delSNAG/flox (tracing-CKO）驗(yàn)證β細(xì)胞向δ細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。利用GFP追蹤Insm1delSNAG突變的β細(xì)胞，在具有β細(xì)胞特異性的insm1delsnag突變體胰腺中發(fā)現(xiàn)與Sst共染色的GFP信號(hào)增強(qiáng)，但在對(duì)照組mTmG；InsCre；Insm1+/flox小鼠中顯著減輕(圖7 B)。結(jié)果說(shuō)明β細(xì)胞向δ細(xì)胞轉(zhuǎn)分化發(fā)生于Insm1delSNAG突變的胰腺β細(xì)胞。

圖6.β細(xì)胞中Nkx6.1+Sst+細(xì)胞數(shù)增多

圖7.Insm1delSNAG突變小鼠中β細(xì)胞向δ細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

4、Insm1delSNAG突變改變了Insm1和Lsd1之間的交互作用

為了進(jìn)一步闡明Insm1的SNAG結(jié)構(gòu)域的分子功能，本研究通過(guò)免疫共沉淀法檢測(cè)與Insm1delSNAG相互作用的蛋白。本文檢測(cè)到Lsd1無(wú)法在轉(zhuǎn)染Insm1del-SNAG-Flag的SJb b細(xì)胞中被Flag抗體拉下來(lái)(圖8A)。這一結(jié)果與先前對(duì)垂體細(xì)胞的觀察結(jié)果一致。Insm1可以在胰腺β細(xì)胞中與NeuroD1和FoxA2互相作用。因此使用NeuroD1和FoxA2抗體在含有Insm1delSNAG-Flag或Insm1-Flag蛋白同一細(xì)胞裂解液中進(jìn)行免疫共沉淀，觀察到Insm1的SNAG域突變并沒(méi)有阻止Insm1與NeuroD1或FoxA2之間的相互作用(圖8A)。因此，Insm1delSNAG突變破壞了Insm1與Lsd1之間的相互作用，但不破壞Insm1與NeuroD1或FoxA2之間的相互作用。

在胰腺β細(xì)胞系中進(jìn)行的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析顯示，Insm1可以結(jié)合在基因內(nèi)含子和下游18kb的Hhex位點(diǎn)(圖8B)，在這些結(jié)合位點(diǎn)周圍有一個(gè)H3K4me1富集區(qū)(圖8B，上圖)。這些特征在胰外分泌細(xì)胞特異性基因Amy1的位點(diǎn)上并沒(méi)有觀察到(圖8B，下圖)。利用Insm1和Lsd1的抗體通過(guò)ChIP-PCR驗(yàn)證Insm1招募的Lsd1的特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果觀察到與Amy1位點(diǎn)相比，Lsd1在Insm1結(jié)合位點(diǎn)，Hhex1的內(nèi)含子和下游18kb區(qū)域富集，同時(shí)Insm1突變體SJb細(xì)胞中Lsd1的這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)富集減少(圖8C和D)。Lsd1特別表現(xiàn)出組蛋白修飾H3K4me2和H3K4me1的去甲基化酶活性。

利用H3K4me1和H3K4me2的抗體在對(duì)照和Insm1delSNAG突變體的胰島中進(jìn)行ChIP-PCR，研究Insm1SNAG-Lsd1是否調(diào)控H3K4me1和H3K4me2兩種組蛋白修飾。結(jié)果檢測(cè)到相比野生型胰島，在Insm1delSNAG突變體的胰島中，H3K4me2在Hhex基因的內(nèi)含子和18 kb下游位點(diǎn)，以及H3K4me1在Hhex的18 kb下游位點(diǎn)有著顯著富集(圖8E和F)。SNAG突變擾亂了Insm1募集Lsd1的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致H3K4me1/H3K4me2水平增加，特別是δ細(xì)胞特異性基因Hhex。

圖8. Insm1的SNAG結(jié)構(gòu)域招募Lsd1

總結(jié)

在目前的研究中發(fā)現(xiàn)與Insm1null突變相比，Insm1的SNAG結(jié)構(gòu)域在α、PP和ε細(xì)胞中導(dǎo)致發(fā)育缺陷，但在β細(xì)胞中沒(méi)有那么嚴(yán)重。Insm1的SNAG突變破壞Insm1和Lsd1之間的相互作用。然而，Insm1-NeuroD1或Insm1-FoxA2的互相作用得以保留。NeuroD1和FoxA2在胰腺β細(xì)胞發(fā)育中起重要作用;Insm1delSNAG與這些因子之間相互作用的維持部分解釋了Insm1delSNAG突變小鼠β細(xì)胞發(fā)育缺陷相對(duì)于Insm1null突變小鼠不那么嚴(yán)重的原因。研究證明了Insm1的SNAG域的突變導(dǎo)致β轉(zhuǎn)分化為δ細(xì)胞。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Insm1的SNAG結(jié)構(gòu)域與Lsd1相互作用并將其吸附到DNA上。突變的SNAG結(jié)構(gòu)域阻斷Lsd1的募集，導(dǎo)致δ細(xì)胞特異性基因Hhex位點(diǎn)的H3K4me1和H3K4me2水平升高。

本文結(jié)論:在胰腺β細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，Insm1部分通過(guò)招募β細(xì)胞來(lái)抑制δ細(xì)胞命運(yùn)Lsd1通過(guò)它的SNAG域。然而，考慮到Lsd1可以以時(shí)間和細(xì)胞依賴性的方式進(jìn)一步招募各種組蛋白修飾復(fù)合物，我們所確定的分子機(jī)制可能只揭示了部分調(diào)控場(chǎng)景。綜上所述，研究證明了Insm1對(duì)于所有胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的分化至關(guān)重要，特別是對(duì)抑制β轉(zhuǎn)分化為δ細(xì)胞。

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