2021年8月，國(guó)內(nèi)第一篇基于10x Genomics單細(xì)胞聯(lián)合10× Visium 空間轉(zhuǎn)錄組的文章在《Cell Research》見(jiàn)刊！文章作者來(lái)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所的劉峰老師課題組和北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的李程老師課題組，利用scRNA-seq和ST技術(shù)構(gòu)建小鼠胎肝（FL）的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示HSCs/MPPs的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，進(jìn)一步解析造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞（HSC/MPP）在其固有生態(tài)位擴(kuò)增的細(xì)胞和分子機(jī)制。
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實(shí)驗(yàn)材料
將雄性CD45.1小鼠與雌性CD45.2小鼠雜交獲得小鼠胚胎；終止妊娠后獲得的人類胚胎；健康志愿者處收集人類臍帶血 (CB) 樣本
ScRNA-seq樣本：經(jīng)FACS分選FL四個(gè)時(shí)間點(diǎn)（E11.5，E12.5，E13.5，和 E14.5）的細(xì)胞，包括造血細(xì)胞（HC）、內(nèi)皮細(xì)胞（EC）和非造血/費(fèi)內(nèi)皮細(xì)胞（NC），之后混合測(cè)序。
ST樣本：使用來(lái)自 E14.5 胚胎沿背腹軸的四個(gè)切片進(jìn)行了 10× Visium ST，重點(diǎn)放在 FL 區(qū)域。
實(shí)驗(yàn)方法
免疫熒光，菌落形成單位(CFU)培養(yǎng)試驗(yàn)，移植試驗(yàn)，蛋白免疫印跡（WB），scRNA-seq，10× Visium ST，小鼠和人之間FL的跨物種分析
文章思路圖
研究背景
在哺乳動(dòng)物中，造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞 (HSCs/MPPs) 占據(jù)造血系統(tǒng)層次結(jié)構(gòu)的頂端，表現(xiàn)出多向分化和自我更新的能力。HSC/MPP 擴(kuò)增的研究為再生醫(yī)學(xué)帶來(lái)了巨大希望，并且科學(xué)家們已經(jīng)做出了重大努力，通過(guò)基因工程或優(yōu)化培養(yǎng)條件來(lái)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的HSC/MPP離體擴(kuò)增。然而，在目前的HSC/MPP離體擴(kuò)增培養(yǎng)中，挑戰(zhàn)的關(guān)鍵是如何保持干細(xì)胞的特性；因此，需要全面了解 HSC/MPP 在體內(nèi)固有生態(tài)位中的擴(kuò)增。高度血管化的胎肝 (FL) 是各種來(lái)源的造血細(xì)胞 (HC)的臨時(shí)發(fā)育部位。研究證明在小鼠中，F(xiàn)L結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、基質(zhì)細(xì)胞和成肝細(xì)胞，并通過(guò)多樣化的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子與HSC/MPP相互作用。HSC/MPP 和不同生態(tài)位細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用的潛在機(jī)制，以及 HSC/MPP 擴(kuò)增的系統(tǒng)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然難以捉摸。
結(jié)果討論
一、發(fā)育中小鼠 FL 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
基于10× Genomics，構(gòu)建E11.5，E12.5，E13.5和 E14.5 FL 的單細(xì)胞分辨率細(xì)胞圖譜，共計(jì)包含有32449個(gè)單細(xì)胞，分為了21個(gè)細(xì)胞簇，包括 18 個(gè) HC 簇和 3 個(gè)結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞簇，并發(fā)現(xiàn)它們的比例與發(fā)育階段動(dòng)態(tài)相關(guān)。四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異基因的GO 分析顯示有絲分裂細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長(zhǎng)也富含不同類型的結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞，表明細(xì)胞數(shù)量和大小的整體增加用以適應(yīng) FL 擴(kuò)張。
圖1 發(fā)育中小鼠 FL 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
a FL組織的scRNA-seq 實(shí)驗(yàn)流程示意圖。b FL中所有單細(xì)胞的UMAP可視化。c熱圖顯示每個(gè)細(xì)胞簇前20個(gè)DEGs的表達(dá)模式。d在 FL 發(fā)育過(guò)程中，HSC/MPP 中富集的 GO通路。e FL發(fā)育過(guò)程中 HSC/MPP 中富集的 DEGs的散點(diǎn)圖。
二、 富含 CD93 的 HSCs/MPPs 表現(xiàn)出增強(qiáng)的干細(xì)胞特性
GO 和 DEG 分析表明 HSC/MPP1-3 中造血調(diào)節(jié)和分化、主動(dòng)翻譯過(guò)程和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等通路富集。HSC/MPP亞群和下游髓系淋巴祖細(xì)胞之間的軌跡分析顯示 HSC/MPP1 占據(jù)造血系統(tǒng)層級(jí)的頂部?？傮w而言，這些結(jié)果表明，與 HSC/MPP2-3 相比，HSC/MPP1 表現(xiàn)出最強(qiáng)大的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征。
圖2 富含CD93 的 HSC/MPP 表現(xiàn)出增強(qiáng)的干細(xì)胞特性
a HSC/MPP三個(gè)亞群的GO富集分析。b三種HSC/MPP亞型中富集的DEG的散點(diǎn)圖。c HSC/MPP1與HSC/MPP2（左）與 HSC/MPP3（右）中所有基因表達(dá)的散點(diǎn)圖。d箱線圖顯示了三種 HSC/MPP 亞型的 hscScore 分布。e軌跡分析重建HSC/MPP 到淋巴和骨髓祖細(xì)胞的譜系分化。f熱圖顯示了三種 HSC/MPP 亞型中HSC/MPP 特征基因和Cd93的表達(dá)模式。g使用 CD93 + SLAM-LSK (CD93 + HSC) 和 CD93 – HSC進(jìn)行初次移植后 8 周受者外周血 (PB) 中供體來(lái)源的嵌合體比例。h使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進(jìn)行初次移植后 20 周時(shí)受者 PB 中供體來(lái)源的嵌合體比例。i在使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進(jìn)行二次移植后 8 周時(shí)受者 PB 中的供體來(lái)源嵌合體比例。j使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進(jìn)行二次移植后 16 周時(shí)受者 PB 中供體來(lái)源的嵌合體比例。
三、 HSC/MPP 和生態(tài)位細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用
利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個(gè)無(wú)偏的 HSC/MPP-生態(tài)位細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)，重點(diǎn)是結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。深入分析確定了參與 HSC/MPP 發(fā)展的幾種眾所周知的配體-受體相互作用，例如 TGFΒ1-TGFΒR1、TEK-ANGPT1 和 IGF2-IGF1R。通過(guò)反卷積分析發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞和成肝細(xì)胞在大多數(shù)斑點(diǎn)中顯示出最高的富集分?jǐn)?shù)，表明它們是 FL 的主要細(xì)胞成分?？傊?，ST 描繪了 FL 的空間組織結(jié)構(gòu)，用以進(jìn)一步解讀 scRNA-seq 預(yù)測(cè)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。
圖3 HSCs/MPPs 和小生境細(xì)胞之間的細(xì)胞間相互作用
a示意圖展示 HSC/MPP 和生態(tài)位細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、成肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）之間的細(xì)胞相互作用。b CellPhoneDB 分析展示主要的 HSC/MPP-生態(tài)位細(xì)胞相互作用對(duì)。c主要的HSC/MPP-生態(tài)位細(xì)胞相互作用對(duì)的配體（頂部）和相應(yīng)受體（底部）表達(dá)模式的散點(diǎn)圖。d 10×Visium ST 實(shí)驗(yàn)流程示意圖。e E14.5 胚胎組織切片的蘇木精和伊紅 (HE) 染色。f組織切片中成肝細(xì)胞標(biāo)記物Afp 的表達(dá)模式。g熱圖展示了FL斑點(diǎn)的富集分?jǐn)?shù)。h FL部分空間特征圖。
四、 HSC/MPP 擴(kuò)增單位的識(shí)別
對(duì)于每種生態(tài)位細(xì)胞類型，不同類型斑點(diǎn)的富集得分分析表明，點(diǎn)內(nèi)得分最高的 EC 接近 HSC/MPP。發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在點(diǎn)內(nèi)富集 11.52 倍，在點(diǎn)間富集 1.31 倍，EC 在點(diǎn)內(nèi)富集 1.62 倍，而肝母細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在點(diǎn)內(nèi)富集較少?？傊?，數(shù)據(jù)結(jié)果支持巨噬細(xì)胞是與 HSCs/MPPs 關(guān)系最密切的重要生態(tài)位細(xì)胞。通過(guò)分析預(yù)測(cè)的交互信號(hào)的空間表達(dá)，發(fā)現(xiàn)編碼配體的基因，如 MDK 和 PTN，在點(diǎn)內(nèi)和點(diǎn)間的生態(tài)位細(xì)胞中高度表達(dá)；并且與受體相關(guān)的基因，如 LRP1 和 PTPRS，在HSCs/MPPs 定位點(diǎn)富集。該結(jié)果證明 FL的 HSCs/MPPs 以多個(gè)單位擴(kuò)增，其中巨噬細(xì)胞和多種生長(zhǎng)因子（包括 MDK 和 PTN）高度富集。
圖4 HSC/MPP擴(kuò)增單元識(shí)別
a點(diǎn)內(nèi)、點(diǎn)間及其他的示意圖。點(diǎn)內(nèi)：HSC/MPP 定位點(diǎn)；點(diǎn)間：HSC/MPP 包圍點(diǎn)；其他，其他遠(yuǎn)端的點(diǎn)。b箱線圖展示點(diǎn)內(nèi)、點(diǎn)間和其他點(diǎn)中生態(tài)位細(xì)胞的富集分?jǐn)?shù)。c箱線圖展示了點(diǎn)內(nèi)生態(tài)位細(xì)胞的歸一化（富集）評(píng)分。d箱線圖顯示點(diǎn)間生態(tài)位細(xì)胞的歸一化（富集）評(píng)分。e FL中Ptn和Ptprs 的共表達(dá)模式。f 空間特征圖展示Ptn-Ptprs豐富的 HSC/MPP 擴(kuò)增單元?；騊tn在生態(tài)位細(xì)胞定位點(diǎn)（頂部，紅色點(diǎn)）和基因Ptprs在HSC/MPP 定位點(diǎn)（頂部，藍(lán)色點(diǎn)）的表達(dá)模式。g FL中Mdk和Lrp1 的共表達(dá)模式。h富含Mdk -Lrp1 的HSC/MPP 擴(kuò)增單元（點(diǎn)間）的空間特征圖。i空間特征圖展示富含Mdk- Lrp1 的HSC/MPP 擴(kuò)增單元（點(diǎn)內(nèi)）。
五、 生態(tài)位細(xì)胞在促進(jìn) HSC/MPP 擴(kuò)增中的作用的功能驗(yàn)證
免疫熒光分析揭示巨噬細(xì)胞可以通過(guò)形成“口袋狀”結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn) HSC/MPP 擴(kuò)增，同時(shí)通過(guò)分泌 MDK 因子促進(jìn) HSC/MPP 擴(kuò)增。10×Visium ST 結(jié)果說(shuō)明了 HSCs/MPPs 和 ECs 之間更密切的空間關(guān)系，免疫熒光分析驗(yàn)證了HSCs/MPPs 被 ECs 包圍。從功能上確定源自結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞的預(yù)測(cè)交互信號(hào)可以調(diào)節(jié) HSCs/MPPs 擴(kuò)增。功能分析驗(yàn)證了潛在的細(xì)胞間相互作用和支持 HSC/MPP 擴(kuò)增的潛在分子機(jī)制。
圖5 巨噬細(xì)胞促進(jìn) HSC/MPP 擴(kuò)增
a免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細(xì)胞）和 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）的表達(dá)。b免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細(xì)胞）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達(dá)。C柱狀圖展示有和無(wú)細(xì)胞相互作用的 HSCs/MPPs 的比例。d免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細(xì)胞）、CD150（代表 HSCs/MPPs）、Mecom（代表 HSCs/MPPs）和 Hlf（代表 HSCs/MPPs）的表達(dá)。f源自巨噬細(xì)胞和 HSC/MPP 共培養(yǎng)系統(tǒng)的 HSCs/MPPs（LSK 細(xì)胞）的數(shù)量。g源自MDK補(bǔ)充培養(yǎng)物的 100 個(gè) HSCs/MPPs（LSK、Flt3 -LSK 和 SLAM-LSK 細(xì)胞）的HSCs/MPPs（LSK 細(xì)胞）的數(shù)量。h氯膦酸鹽-脂質(zhì)體和對(duì)照-脂質(zhì)體處理后 E14.5 FL 中的總細(xì)胞數(shù)。i氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL中譜系- (Lin- ) 細(xì)胞的比例。j氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL 中 LSK 細(xì)胞的比例。k氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL 中 SLAM-LSK 細(xì)胞的比例。l流式細(xì)胞儀分析顯示E14.5 FL在氯膦酸鹽處理前后Lin -，LSK，SLAM-LSK的細(xì)胞比例。
圖6 促進(jìn) HSCs/MPPs 擴(kuò)增的結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞
a 免疫熒光分析顯示了在 E14.5 FL 冷凍切片中 Lyve1（代表ECs）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達(dá)。b免疫熒光分析顯示了 E14.5 FL 冷凍切片中 Lyve1（代表EC）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達(dá)。c免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）、Runx1（代表 HSCs/MPPs）和 EphrinB2（代表動(dòng)脈門脈血管）的表達(dá)。d免疫熒光分析顯示 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）、Runx1（代表 HSCs/MPPs）和 EphB4（代表靜脈）在 E14.5 FL 冷凍切片中的表達(dá)。e Igfbp1、Igfbp5和Igfbp7在三種結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和成肝細(xì)胞）中的表達(dá)模式散點(diǎn)圖。f來(lái)自 E14.5 FL 的 100 個(gè) SLAM-LSK 細(xì)胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細(xì)胞）的數(shù)量。g來(lái)自 E14.5 FL的 100 個(gè)Flt3-LSK 細(xì)胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細(xì)胞）的數(shù)量。h來(lái)自 E14.5 FL 的 100 個(gè) LSK 細(xì)胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細(xì)胞）的數(shù)量。
六、 小鼠和人類FL造血功能的跨物種分析
本文數(shù)據(jù)揭示了小鼠和人類 FL 之間保守的細(xì)胞類型和造血分化途徑，說(shuō)明人類和小鼠之間保留了許多 FL HSC 擴(kuò)增機(jī)制，但 HSCs/MPPs 中也存在物種特異性轉(zhuǎn)錄組特征。
圖7 小鼠和人類FL造血的跨物種分析
a E14.5 FL中所有細(xì)胞類型的UMAP 可視化。b來(lái)自小鼠（E14.5）和人類（受孕后 11 周）的 FL 細(xì)胞群的 UMAP 可視化。c對(duì)人類 HSCs/MPPs中top DEG 進(jìn)行 GO 生物過(guò)程相關(guān)的通路富集分析。d對(duì)小鼠 HSCs/MPPs 中top DEG進(jìn)行GO生物過(guò)程相關(guān)的通路富集分析。e配體-受體相互作用網(wǎng)絡(luò)展示了人 HSC/MPP與生態(tài)位細(xì)胞之間的潛在通訊網(wǎng)絡(luò)。f熱圖展示主要的人 HSCs/MPPs-生態(tài)位細(xì)胞相互作用對(duì)。g – h免疫熒光分析展示CD68（代表巨噬細(xì)胞）和 CD34（代表 HSCs/MPPs）在人受孕后第 11 周 FL 切片中的表達(dá)。i柱狀圖展示有和無(wú)細(xì)胞相互作用的 HSCs/MPPs 所占的比例。j源自小鼠巨噬細(xì)胞和 HSCs/MPPs 共培養(yǎng)系統(tǒng)的人 CD34 + HSCs/MPPs的數(shù)量。
研究結(jié)論
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了三種具有轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的亞群，其中CD93+亞群表現(xiàn)出增強(qiáng)的干細(xì)胞特性。此外，通過(guò)整合單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)了新的HSCs/MPPs‘口袋樣’單元(HSC PLUS)，由生態(tài)位細(xì)胞 (肝母細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞) 組成，并富含生長(zhǎng)因子。出乎意料的是,巨噬細(xì)胞在HSC PLUS中表現(xiàn)出了11倍的富集結(jié)果。在功能上，巨噬細(xì)胞- HSC /MPP共培養(yǎng)檢測(cè)和候選分子檢測(cè)分別驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞和生長(zhǎng)因子(MDK、PTN和IGFBP5)在HSCs/MPPs擴(kuò)增中的支持作用。該研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)解讀了HSCs/MPPs擴(kuò)增的結(jié)構(gòu)和分子基礎(chǔ)。最后,跨物種分析和功能驗(yàn)證表明細(xì)胞間相互作用和擴(kuò)增機(jī)制具有保守性，但小鼠和人FL的HSCs/MPPs之間的轉(zhuǎn)錄組特征同時(shí)存在差異。綜上所述，本文為了解FL中HSCs/MPPs的發(fā)生發(fā)展以及體外功能性HSCs/MPPs擴(kuò)增提出了的新見(jiàn)解。
參考文章：
Gao, S., Shi, Q., Zhang, Y. et al. Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics. Cell Res (2021). https://doi.org/10.1038/s41422-021-00540-7
原文下載鏈接：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34341490
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