心臟是第一個(gè)發(fā)育完整的功能器官，對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要。心臟發(fā)生涉及來自多個(gè)譜系的異質(zhì)性細(xì)胞群，它們?cè)跁r(shí)空上相互作用，以驅(qū)動(dòng)心臟的發(fā)育。心臟發(fā)育過程中細(xì)胞類型的異質(zhì)性使得利用傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)技術(shù)研究心臟變得困難。雖然單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)已被用于研究心臟發(fā)育中涉及的細(xì)胞機(jī)制，但是它不能保存空間信息，也不能研究細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生之間復(fù)雜的相互作用。在這里，作者結(jié)合空間和高通量單細(xì)胞數(shù)據(jù)來研究雞胚胎心臟發(fā)育的時(shí)空相互作用和調(diào)控機(jī)制。百邁客不僅提供單細(xì)胞系列產(chǎn)品，6大核心產(chǎn)品，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫、單細(xì)胞ATAC-seq、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組，而且實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組百邁客云端APP分析，深入大數(shù)據(jù)挖掘，一鍵快速分析，單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析近似實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率的空間異質(zhì)性，助您進(jìn)入時(shí)空組學(xué)研究新時(shí)代。接下來我們來看看作者如何實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合研究雞的心臟發(fā)育過程。
英文題目：Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis
中文題目：時(shí)空單細(xì)胞RNA測(cè)序確定了雞心臟發(fā)育過程中細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生之間的相互作用
期刊名稱：Nature Communications
影響因子：14.919
原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7979764/
4個(gè)階段的雞卵；scRNA-seq；stRNA-seq；smFISH；Immunohistochemistry
結(jié)果
1、胚胎雞心臟發(fā)育的空間解析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)調(diào)查
? ? ? ? 為了研究心臟發(fā)育過程中分化和形態(tài)發(fā)生之間復(fù)雜的相互作用，作者結(jié)合了單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，分析了雞心臟Hamburger-Hamilton心室發(fā)育的四個(gè)關(guān)鍵階段。最終生成了22315個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和覆蓋6800多個(gè)spots的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。
? ? ? ? 通過對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行降維、聚類及可視化分析，最終確定了15個(gè)不同的心肌細(xì)胞類型簇。除了心肌細(xì)胞類型，作者還檢測(cè)到少量的紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的異質(zhì)性細(xì)胞群，該細(xì)胞能高水平表達(dá)beta-4 (TMSB4X)。對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獨(dú)立分析確定了具有差異轉(zhuǎn)錄程序的解剖區(qū)域。將空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，作者構(gòu)建了所有心肌細(xì)胞類型對(duì)的接近圖，并將其可視化為弦圖(圖1e)。研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞在第7天與心內(nèi)膜細(xì)胞共定位，在第10天和第14天與血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共定位，這是可預(yù)料的，因?yàn)樵诘?天，心內(nèi)膜細(xì)胞排列在小梁狀心肌中，而在第10天，血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞出現(xiàn)在致密心肌中。??
? ? ? ? 作者收集并重組了來自心外膜、心內(nèi)膜和心肌譜系的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，然后重建譜系分化軌跡。通過對(duì)上皮細(xì)胞(TCF21+?，WT1+， TEK?)、間充質(zhì)細(xì)胞(TCF21+?，TEK?)、成纖維細(xì)胞(TCF21+?，POSTN+?，TEK?)和壁細(xì)胞進(jìn)行心外膜譜系分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)豐富的時(shí)空分化過程。對(duì)來自心室游離壁的5621個(gè)心外膜細(xì)胞簇進(jìn)行分析，識(shí)別出五個(gè)主要細(xì)胞簇:一個(gè)早期心外膜祖細(xì)胞簇(C1)，兩個(gè)中間前體細(xì)胞簇(C2和C3)，一個(gè)成纖維細(xì)胞簇(C4)和一個(gè)壁細(xì)胞簇(C5)。
? ? ? ? 其中，細(xì)胞集群C1主要是來源于HH24(第四天)心室和心外膜祖細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)了與心外膜發(fā)育相關(guān)的維甲酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生長因子MDK。細(xì)胞簇(C2和C3) 主要出現(xiàn)在EMT的HH31(第7天)階段。C2簇表達(dá)于胚胎心臟最外層的心外膜，主要為TCF21+、WT1+、TBX18+，并使MDK表達(dá)上調(diào)。C3細(xì)胞群以TBX18?和WT1?為主，高水平的表達(dá)了與細(xì)胞遷移有關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)錄本，上調(diào)了EMT調(diào)節(jié)因子SNAI1的表達(dá)。將細(xì)胞類型標(biāo)記轉(zhuǎn)移到空間數(shù)據(jù)表明，在第7天和第10天心臟分期中，只有上皮細(xì)胞(心外膜亞簇C1和C2)在空間上局限于心室壁最外層的心外膜層。然而，在第7天，表間質(zhì)(心外膜C3亞簇)在空間上并不局限于心外膜外層，這表明它們駐留在心肌而不是心外膜外層。??
到第10天(HH36)時(shí)，成纖維細(xì)胞(C4)表達(dá)COL3A1和DCN，壁細(xì)胞(C5)表達(dá)ACTA2、MYH11、TAGLN和RGS5。然而，此時(shí)心外膜最外層的一些細(xì)胞仍然保持中間未分化表型。到第14天(HH40)時(shí)，大多數(shù)心外膜層細(xì)胞已分化為成纖維細(xì)胞，這是由其定位到第14天心外膜所提示的，而其他成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞如預(yù)期的一樣定位于整個(gè)心肌。軌跡重建證實(shí)了第7天的分支細(xì)胞發(fā)育以及第10天的分支合并和分化(圖2c)。在第7天和第10天發(fā)現(xiàn)了顯著的分期變異性，在心外膜內(nèi)層存在未分化細(xì)胞，而在心肌中存在分化細(xì)胞(圖2d)。
? ? ? ?為了支持心外膜譜系的結(jié)果，作者在第7天(HH31)心臟切片上進(jìn)行了smFISH實(shí)驗(yàn)。smFISH的結(jié)果驗(yàn)證了scRNA-seq和空間RNA-seq的結(jié)果，并與這些細(xì)胞群來自心外膜譜系的可能性的結(jié)果相一致。???
3、時(shí)空上解決了心臟組織發(fā)育過程中局部細(xì)胞異質(zhì)性
? ? ? ? ?為了研究胚胎心室的空間轉(zhuǎn)錄差異，作者對(duì)空間數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類，并根據(jù)其在組織中的位置對(duì)聚類進(jìn)行解剖區(qū)域標(biāo)記。?通過分析，作者識(shí)別出心室、心房、瓣膜和流出道的不同空間簇，也識(shí)別出心室區(qū)域的不同層，包括心外膜、心肌致密區(qū)、小梁區(qū)以及心內(nèi)膜。
? ? ? ? ?為了檢測(cè)區(qū)域特異性標(biāo)記，作者在各個(gè)階段對(duì)解剖區(qū)域進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。在第7天和第10天發(fā)現(xiàn)了左右心室的轉(zhuǎn)錄差異。這些差異在第14?天心臟發(fā)育完成時(shí)減小。與右側(cè)相比，左心室中TBX5的表達(dá)顯著富集，并且這種差異隨著第7天至第14天的分期而降低（圖3d）。從第7天開始，CHGB的表達(dá)主要局限于右心室，ACTG2在第7天表達(dá)于右心室（圖3f和3g）。TBX5明確了左右心室腔室的位置，并已被證明在發(fā)育中的雞的左心室中富集。Takeuchi等人的報(bào)道的在右心室特異性表達(dá)的TBX20，在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中并沒有得到證實(shí)（圖3e）。從第7天到第14天的scRNA-seq數(shù)據(jù)集沒有捕捉到TBX5、?ACTG2和CHGB在心室中表達(dá)的顯著差異，盡管它們似乎確實(shí)傾向于在其擬心室的的細(xì)胞中高表達(dá)。?smFISH證實(shí)了TBX5在左心室小梁心肌細(xì)胞中上調(diào)，并這種富集隨著發(fā)育階段而減少（圖3i）。smFISH實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了?TBX20在不同階段的左、右心室的表達(dá)水平非常低（圖3i）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，肌紅蛋白（MB）的表達(dá)在空間上局限于后期發(fā)展的致密心肌層，這表明心肌細(xì)胞向更成熟的表型轉(zhuǎn)化，需要更大的氧氣（圖3h）。考慮局部細(xì)胞類型組成，發(fā)現(xiàn)MB的上調(diào)是由于不成熟肌細(xì)胞增加和肌細(xì)胞疏松心肌中MB表達(dá)增加的結(jié)果造成的（圖3b）。相反，NPPB基因在空間上局限于形成小梁狀心肌層，如預(yù)期的一樣。作者進(jìn)一步探索了空間數(shù)據(jù)集，以確定先天性心臟缺陷（CHD）相關(guān)基因表達(dá)的時(shí)空模式。在50多個(gè)人類基因中，顯性功能的突變喪失已被發(fā)現(xiàn)與冠心病有關(guān)。這些基因在發(fā)育過程中，通過以高度特定的時(shí)空模式表達(dá)調(diào)控水平來預(yù)測(cè)在冠心病中，基因型和表型之間可能存在很強(qiáng)的相關(guān)性。對(duì)CHD相關(guān)基因進(jìn)行了空間RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如GATA5的表達(dá)在瓣膜區(qū)域富集，IRX4的表達(dá)局限于心室組織，TBX5在左心室富集（圖4a-b和圖3d）。PITX2基因是早期中胚層的主要調(diào)控因子，也是決定器官的關(guān)鍵成分，在心臟左側(cè)富集（圖4c）。冠心病相關(guān)肌體蛋白編碼基因如ACTC1和GJA5在心房和心室組織中表達(dá)豐富，而MYH7僅局限于心房（圖4d-f）。?
4.?胸腺素beta-4在冠狀血管細(xì)胞中持續(xù)富集
? ? ? ? 通過對(duì)scRNA-seq聚類分析，鑒定出一個(gè)富含TMSB4X的異質(zhì)性細(xì)胞簇，包含來自所有四個(gè)發(fā)育階段的細(xì)胞（圖1b）。TMSB4X編碼beta-4，這是一種眾所周知的多效性分泌小肽，在肌動(dòng)蛋白-細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、存活和分化中起著重要作用。為了深入研究了TMSB4X細(xì)胞表型的異質(zhì)性及其轉(zhuǎn)錄譜，作者將1075個(gè)TMSB4X細(xì)胞重新聚類，并檢查其細(xì)胞類型組成（圖5a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)簇1主要由表達(dá)TCF21?的心外膜細(xì)胞和表達(dá)心內(nèi)膜標(biāo)記物的IRX6和NPC2的心內(nèi)膜細(xì)胞組成（圖5a，右）。簇2主要由差異表達(dá)的ACTA2的血管壁細(xì)胞組成（圖5a，右）。簇3主要由差異性表達(dá)FABP5和?TM4SF18的冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞組成（圖5a，右）。stRNA-seq數(shù)據(jù)表明，在后期階段，TMSB4X在瓣膜和心室壁中富集。對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育階段，beta-4表達(dá)略有增加，在冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞亞簇2中beta-4表達(dá)最高。差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞骨架組織相關(guān)的基因?VIM、RHOA、ACTB、?ACTG1和DSTN?顯著上調(diào)（圖5b）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了被beta-4激活的鈣結(jié)合蛋白CALM1和?CALM2的上調(diào)，兩種蛋白與細(xì)胞周期進(jìn)展、增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)?？偟膩碚f，TMSB4X可以增強(qiáng)細(xì)胞骨架組織活性和鈣信號(hào)。
? ? ? ? 為了進(jìn)一步確定beta-4的具體類型，作者進(jìn)行了smFISH?和免疫組化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在第4?天 （?HH24）時(shí)，beta-4 mRNA在心外膜和心內(nèi)膜中表達(dá)最高。在第7天（?HH31）時(shí)，beta-4 mRNA在冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)最高。在第10天（HH36）時(shí)，beta -4?在?CDH5+?血管內(nèi)皮細(xì)胞和周圍的壁細(xì)胞（CDH5-，PDGFRB+）中表達(dá)最高。在第14天（HH40）時(shí)，?TMSB4X?在?CDH5+?血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)仍然較高，而在?PDGFRB+ CDH5-壁細(xì)胞中表達(dá)較低。免疫組化進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)?？傊?，結(jié)合空間分辨率的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和影像學(xué)數(shù)據(jù)顯示，TMSB4X?在所有細(xì)胞類型中普遍表達(dá)，但在冠狀動(dòng)脈細(xì)胞中富集，從冠狀動(dòng)脈血管發(fā)育的開始，到心室發(fā)育過程中冠狀動(dòng)脈血管的成熟。
? ? ? ? 作者將單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合起來，以高時(shí)空分辨率探索了雞心臟的早期發(fā)育階段，構(gòu)建了一個(gè)具有單細(xì)胞和空間分辨率的基因表達(dá)譜系，揭示了幾種調(diào)控機(jī)制，并證明了scRNA-seq和stRNA-seq可以用于研究細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組研究空間基因表達(dá)異質(zhì)性，甚至空間細(xì)胞異質(zhì)性，單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)將會(huì)在更多的領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)
Mantri M, Scuderi GJ, Abedini-Nassab R,?et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 2021 Mar 19;12(1):1771.
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