【案例解讀】【PNAS】【微生物多樣性】全球范圍海洋沉積物的微生物多樣性研究

中文名: 全球范圍海洋沉積物的微生物多樣性研究

英文名: Global diversity of microbial communities in marine sediment

雜志：PNAS，2020

影響因子：9.58

研究背景

海洋沉積物富含生物質，并且它是未知的微生物多樣性的來源，微生物細胞密度高達每立方厘米109個細胞（比水體高出五個數(shù)量級）。海洋沉積物包括粘土，腐爛的有機物，鈣質殘余物和其他固體沉積物。
海洋沉積物中的微生物群落控制生態(tài)過程，影響?zhàn)B分供應和土壤化學特性。海洋環(huán)境是地球上最具生產力的生態(tài)系統(tǒng)之一，但是人為影響對于海岸生態(tài)多樣性產生明顯影響，導致微生物群落功能轉變和人類健康風險因素。海洋沉積物中的微生物對全球生物量的貢獻巨大，是地球系統(tǒng)的重要組成部分。海底沉積物既包括好氧微生物生態(tài)系統(tǒng)，也包括厭氧微生物生態(tài)系統(tǒng)，它們在不同的地質時期依靠著極低的生物可用能量生存。然而，海洋沉積微生物群落的分類多樣性及其在全球范圍內的空間分布一直沒有得到深入的調查和研究。

材料方法

1、實驗樣本：
作者通過調查了來自全球分布的40個不同地點，共299個沉積物巖芯樣品。這些樣品位于海底以下0.1-678米的深度位置，樣品采集后立即冷凍于-80℃環(huán)境中保存。

圖1 采樣地點的位置。紅色圓圈分別表示海洋邊緣站點，紅色方塊分別表示開放海洋站點。淺藍色和深藍色區(qū)域分別顯示整個沉積物中可能發(fā)生溶解氧和有氧活動的最大和最小區(qū)域。在14次科學考察中，從40個地點采集了海底以下許多不同深度的299個沉積物樣本，用于比較不同全球海底沉積物微生物群落組成。

2、實驗和分析方法

使用試劑盒提取DNA，以提取的DNA為模板進行PCR擴增出細菌的16S核糖體區(qū)，使用引物對(U515F/U806R；518F/926R；517F/958R)進行16S rRNA基因擴增和測序，共獲得超過4700萬條16S rRNA基因序列。將Archaea、Bacteria和Universal datasets分別抽平至10,183、10,092和10,546條序列，并通過5個SAR模型用于鑒定多樣性特征。

圖2 實驗分析流程參考

研究結果

1、古菌和細菌的群落物種組成
缺氧海底沉積物中古菌群落的分類學組成與含氧海底沉積物中的古菌群落區(qū)系組成顯著不同（圖3 A和C）。圖3A顯示了古菌測序文庫的結果，用于展示235個沉積物樣本的古菌群落組成，Crenarchaeota的成員分布最為廣泛。Euryarchaeota和Asgardaeota在某些厭氧地區(qū)中非常豐富，例如波羅的海和Shimokita Peninsula半島。一些來自日本海、秘魯邊緣和ShimokitaPeninsula半島的樣本中，Hadesarchaeaeota高達古菌群落的70%以上，其相對豐度隨著沉積物深度的增加而增加。Nanoarchaeaeota的成員在最深層沉積物樣品中豐度最高，約占比95%。而在有氧環(huán)境中，Thaumarchaeota（例如Nitrososphaera）的成員占據(jù)主導地位。在3,892條古菌擴增子序列中，在古菌數(shù)據(jù)集中檢測到的ASV中有260個ASV是常見的，這260個ASV約占古菌序列總數(shù)的70%。

使用通用引物對獲得的古菌群落組成與使用古菌特異性引物獲得的群落組成略有不同。對于大多數(shù)沉積物樣品，Asgardaeota在通用引物獲得的數(shù)據(jù)集里占據(jù)主導地位，而Crenarchaeota和Euryarchaeota在古菌專用引物數(shù)據(jù)集中占主導地位。這些差異證實了引物覆蓋范圍會影響表觀的物種群落組成。盡管兩個引物擴增的數(shù)據(jù)集之間存在細微的差異，但兩個數(shù)據(jù)集都表明缺氧沉積物中的古菌群落與含氧沉積物中的古菌群落顯著不同。例如，古菌專用引物數(shù)據(jù)集和通用引物數(shù)據(jù)集都顯示Thaumarchaeota僅在來自含氧沉積物的樣品中占主導地位。
對于大多數(shù)樣品而言，通用引物數(shù)據(jù)集中的古菌相對豐度低于10%（圖3C），盡管由于PCR效率的差異，該結果不是定量的。先前的研究使用數(shù)字PCR定量技術來確定開放海洋沉積物和邊緣海洋沉積物中古菌的百分比分別為5.6和22.6%。本研究中的百分比分別為4.3和12.2%。盡管這些百分比略低于先前的研究，但它們一致表明在海底沉積物中細菌的豐度高于古菌，且占主導地位。

與古菌群落類似，缺氧沉積物中的細菌群落與含氧沉積物中的細菌群落存在很大差異（圖3B和C）。從細菌特異性引物和通用引物獲得的細菌群落組成大致一致。在含氧的海底沉積物中，包括Alphaproteobacteria和Betaproteobacteriales（γ-proteobacteriaes）在內的Proteobacteria成員與Firmicutes成員一起占主導地位。相反，缺氧沉積物中普遍存在Atribacteria、Chloroflexi和Planctomycetes的成員。但是，一些缺氧沉積物，例如從孟加拉灣采集的樣本，典型的含氧沉積物細菌群落占據(jù)了較高的豐度。盡管厭氧和需氧細菌群落的優(yōu)勢成員之間存在一致的差異，但厭氧和需氧菌群落共有30,874個ASV中的5,212個。這5212個ASV共同構成了作者數(shù)據(jù)集中16SrRNA序列的大約80%。

圖3 海洋沉積微生物群落的物種區(qū)系組成。（A）使用古菌特異性引物獲得的235個樣品的古菌群落組成。（B）使用細菌特異性引物獲得的272個樣品的細菌群落組成。（C）使用通用引物獲得的245個樣品的古菌群落組成和281個樣品的細菌群落組成，未顯示少于1,000條序列的樣本。淺藍色折線圖以對數(shù)刻度顯示沉積物深度。

2、海洋沉積物中微生物群落與海水和表層土壤土微生物群落的比較

為了評估海洋沉積微生物群落與其他主要環(huán)境中微生物群落的關系，作者將海洋沉積物通用引物與使用相同通用引物的引物進行微生物群落分析的海水和表層土壤的已發(fā)表序列進行了比較。本研究中這三種生態(tài)環(huán)境的微生物群落中的細菌和古菌群落組成明顯不同（圖4）。如圖3所示，Crenarchaeota和Asgardaeota在海洋沉積物中占優(yōu)勢，而Euryarchaeota和Thaumarchaeota在海水中占優(yōu)勢，而Thaumarchaeota在表層土壤中占優(yōu)勢。細菌群落組成表明變形桿菌在表層土壤和海洋中占據(jù)優(yōu)勢。此外，Cyanobacteria，Marinimicrobia和Bacteroidetes在海水中占主導地位，而Acidobacteria和Verrucomicrobia在表層土壤中更為重要。在海洋沉積物中普遍存在著Atribacteria和Aerophobetes，但其他兩個環(huán)境中卻沒有這些細菌，這表明海洋沉積微生物構成了一個獨特的生物群落。ASV組成的樣品間相似性表明這三個生物群落中的群落不同（圖4B），海洋沉積物中樣品間的多樣性更高。與其他環(huán)境相比，這種高多樣性可能反映了海洋沉積物棲息地條件的劇烈變化。

圖4 比較海洋沉積物、海水和表層土壤的微生物群落組成。（A）使用16S rRNA通用引物獲得的古菌和細菌群落組成。（B）使用從ASV中獲得的Jaccard相似性指數(shù)值生成的NMDS排序圖。

3、限制海洋沉積物中微生物群落組成的環(huán)境因素

為了了解哪些環(huán)境因素在全球范圍內和廣泛的沉積物深度范圍內限制了微生物群落組成，作者對群落組成和各種環(huán)境特性進行了非度量多維尺度分析（NMDS）。這些環(huán)境屬性包括水深、沉積物深度、硫酸鹽濃度、總有機碳濃度以及是否存在溶解氧。全球范圍內海洋沉積物古菌群落可分為兩大類：需氧開放性海洋類和生存于富含有機物生境的厭氧類。細菌群落類似地分為有氧和厭氧的類群，它們生活在大陸邊緣和其他上升流區(qū)域（圖5B）。缺乏溶解氧和高濃度的有機質顯著促進了海洋沉積微生物群落的物種分類組成，從而促進了好氧和厭氧海洋沉積微生物生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)功能。NMDA排序結果結果表明沉積物深度可能與群落組成獨立相關。這種關系可能是由于隨著沉積物深度的增加，營養(yǎng)物質和能量基質的可用性降低。
為了檢查地理距離和沉積物巖性與微生物群落組成之間的相關性，作者對每個站點的群落組合進行了Mantel測試。地理距離與群落組成之間的正相關性相對較弱，沉積物巖性與群落組成密切相關。這種強相關性可能是由于沉積物來源和沉積速率不同而導致的不同沉積巖性中有機物的數(shù)量和組成不同所致。對于單個沉積物樣品，沉積速率和沉積物年齡也可能是群落組成的重要決定因素。

圖5 海洋沉積物微生物群落的β多樣性。（A–C）使用Jaccard相似性指數(shù)值生成的古菌（A），細菌（B）和通用引物數(shù)據(jù)集的NMDS排序圖。紫色箭頭表示與特征為P <0.01的環(huán)境因子相符的向量。（D–F）基于Jaccard相似性指數(shù)值，分別對40個地點的古菌（D），細菌（E）和通用引物數(shù)據(jù)集（F）進行算術平均（UPGMA）樹狀圖的非加權成對分組法。（G）基于40處沉積物的礦物成分的UPGMA巖性樹狀圖。（H）確定地理距離或巖性是否與微生物群落組成相關。

4、海洋沉積物中微生物群落組成的網(wǎng)絡分析

為了確定共現(xiàn)模式，作者基于使用通用引物獲得的ASV的Spearman相關性進行了網(wǎng)絡分析（r> 0.6，P <0.05；圖6）。生成的網(wǎng)絡圖包含1,533個節(jié)點（ASV），網(wǎng)絡的模塊化程度很高（0.84）。在圖6B中，僅顯示了10個最大的模塊，其中5個群落在有氧環(huán)境中普遍存在的模塊（群落1、5、8、9和10）和五個在缺氧沉積物中普遍存在的ASV組成的模塊（群落2、3、4、6和7）。在這10個群落中，群落1包含最多數(shù)量的ASV（84個ASV），主要由Chloroflexi、Proteobacteria和Thaumarchaeota組成（圖6C）。網(wǎng)絡圖顯示，Chloroflexi和Thaumarchaeota是共現(xiàn)網(wǎng)絡的重要成員（圖6A）。在五個缺氧沉積物群落中，群落3主要由Atribacteria、Chloroflexi和Planctomyces組成。網(wǎng)絡分析表明Chloroflexi是海洋沉積物環(huán)境中重要的微生物組成。但是，幾乎所有Chloroflexi都與MSBL9相關聯(lián)，有報道表明MSBL9適合利用多種復雜的糖聚合物。簡而言之，共生網(wǎng)絡分析表明，海洋沉積物微生物群落組成受沉積物中氧化還原態(tài)和電子供體的影響。該分析結果還表明，海底沉積微生物彼此相互作用，以有效利用這種極端環(huán)境中可用的有限基質。

圖6 共存的ASV網(wǎng)絡分析。節(jié)點大小與PageRank成正比。

5、海洋沉積物中微生物群落豐富度的深度變化規(guī)律

為了估計每個樣品的分類學豐富度，從樣品的序列數(shù)據(jù)中隨機抽取1,000條序列，并用于計算樣本的ASV豐富度（Chao1）。細菌ASV和古菌ASV豐富度都隨著缺氧沉積物深度的增加而降低（圖7）。但是，在含氧沉積物中，細菌的豐富度通常隨深度的增加而降低，而古菌的豐富度在整個沉積物柱中都保持相對恒定。細菌豐富度比古菌豐富度高10倍，缺氧沉積物也比含氧沉積物高（圖7B），這可能是因為富含有機物的缺氧沉積物通常比缺乏有機物的含氧沉積物具有更高的微生物豐度。通常，與深度相關的豐富度下降的陡度與淺層沉積物中群落的豐富度成正相關。例如，基于缺氧沉積物中ASV豐富度和沉積物深度的回歸線的斜率比含氧沉積物中的曲線陡峭（圖7 A–C），與含氧沉積物相比，無氧沉積物中較小的初始豐富度在海底選擇壓力下得以生存。類似地，在缺氧和含氧沉積物中，隨著沉積物深度的增加，古菌的富度下降不如細菌富度大。古菌豐富度隨深度降低的程度較低，這與古菌類群比細菌類群對低能量可利用性的一般耐受性有關。然而，盡管古菌豐富度隨沉積物深度降低的速率較低，但在所有沉積物深度，古菌豐富度通常都低于細菌豐富度。

圖7 含氧海洋沉積物和缺氧海洋沉積物中微生物豐富度的深度分布。

6、海洋沉積物中微生物群落的總分類學豐富度
作者使用了三組16SrRNA基因序列文庫（古菌，細菌和Universal）來估計海洋沉積物中ASV的數(shù)量。為了確保作者的結果的可信性，作者同時利用以上五種SAR方法估計了其他生境中古菌和細菌多樣性，包括表層土（topsoil）、海水（seawater）、海底（subseafloor）和海洋（ocean），結果可作為參考數(shù)據(jù)使用，發(fā)現(xiàn)測序深度和是否去除污染物對使用SAR方法估計多樣性差別不大。
在這五個模型中， AIC得分表明，asymptotic模型和Gitay模型對于這三個數(shù)據(jù)集而言是最佳和次佳的。如果將其外推到海洋沉積物的總量，則使用asymptotic模型時古菌ASV的總數(shù)為7.85×103，而使用Gitay模型時則為6.10×105。使用asymptotic模型，全球海洋沉積物中細菌ASV的總數(shù)為3.28×104，而使用Gitay模型，則為2.46×106。在這兩個模型中，細菌豐富度大約比古菌豐富度高四倍。對于古菌，模型外推的范圍是6.18×103至7.90×1015，對于細菌ASV，模型外推的范圍是2.88×104至1.32×1015。使用通用數(shù)據(jù)集估算全球多樣性，作者再次發(fā)現(xiàn)asymptotic模型是最佳模型，古菌和細菌的多樣性分別為1.98×103和3.90×104。該結果與上述細菌和古菌數(shù)據(jù)集的結果一致。使用asymptotic模型和Gitay模型進行的估算遠低于先前對地下地下生物群落中微生物分類學豐富度的估算（即109至1012）。作者認為使用Arrhenius模型計算的全局ASV值是一個很大的高估。

總結

在本研究中，作者調查了來自全球分布的40個不同地點，共299個沉積物巖芯樣品。這些樣品位于海底以下0.1-678米的深度位置，通過高通量測序共獲得超過4700萬條16S rRNA基因序列，較大的測序深度使得所有樣本之間能夠互相進行準確的比較。
統(tǒng)計分析表明，物種分類組成、沉積有機碳濃度和溶解氧之間存在顯著的相關性。物種-區(qū)域擬合關系模型發(fā)現(xiàn)海洋沉積物中古菌和細菌的物種豐富度分別為7.85×103~6.10×105和3.28×104~2.46×106，表明海洋沉積物中微生物的豐度大小可以與表層土壤和海水的物種豐富度相媲美。