2021?年?5?月?11?日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)與北京百邁客生物科技有限公司合作的鴨腸道菌群研究的文章在Science of the Total Environment（IF 7.96）在線(xiàn)發(fā)表，該文章使用全長(zhǎng)16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)研究了砷誘導(dǎo)下導(dǎo)致的腸道微生物菌群失調(diào)和腸道屏障損傷，并揭示了砷誘導(dǎo)的鴨肝臟和空腸炎癥是由LPS/TLR4/NF-kB信號(hào)通路和NLRP3炎癥小體的激活引起的。以下是對(duì)該文章的詳細(xì)解讀。
文章信息
英文主題：Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks
中文主題：砷暴露引起鴨腸道屏障損傷進(jìn)而激活腸-肝軸導(dǎo)致肝臟炎癥和細(xì)胞凋亡
發(fā)表期刊：Science of the Total Environment
影響因子：7.96
發(fā)表時(shí)間：2021?年?5?月
研究亮點(diǎn)
? 砷會(huì)引起鴨肝臟和腸道毒性，帶來(lái)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)
? 砷暴露導(dǎo)致腸道微生物群失調(diào)和屏障損傷
? 砷可通過(guò)?TLR4/NF-κB?和?NLRP3 通路觸發(fā)炎癥反應(yīng)
? 砷誘導(dǎo)的肝毒性與腸-肝軸的激活有關(guān)
研究概覽
研究方法
組織病理學(xué)研究，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?(ELISA)，定量實(shí)時(shí)?PCR (qRT-PCR)，蛋白質(zhì)印跡分析，免疫組化，免疫熒光分析，16S全長(zhǎng)腸道微生物多樣性測(cè)序分析
摘要
砷元素廣泛存在于自然界中，砷及砷化合物是常見(jiàn)的有毒有害類(lèi)污染物，常見(jiàn)于受污染的土壤、河流和地下水中。然而，關(guān)于三氧化二砷?(ATO)?對(duì)水禽的腸-肝軸和隨之而來(lái)的肝毒性的影響的研究很少。在此，我們研究了?ATO?對(duì)鴨腸和肝臟的影響，并探討了腸肝軸在?ATO?誘導(dǎo)的肝毒性和腸道毒性中的作用。結(jié)果表明，ATO?暴露會(huì)導(dǎo)致腸道損傷、肝臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和囊泡脂肪變性。此外，暴露于?ATO?的鴨子的腸道微生物群落顯示出顯著降低的α多樣性和細(xì)菌群落的改變。并且，ATO?暴露顯著降低了腸道屏障相關(guān)蛋白（Claudin-1、MUC2、ZO-1?和?Occludin）的表達(dá)，導(dǎo)致腸道通透性增加和脂多糖水平升高。同時(shí)，ATO?暴露還上調(diào)肝臟和空腸中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的指數(shù)水平，并增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生（IFN-γ、TNF-α、IL-18?和?IL-1β）。我們進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，ATO?誘導(dǎo)的肝臟和空腸炎癥是由?LPS/TLR4/NF-κB?信號(hào)通路和?NLRP3?炎癥小體的激活引起的?？傊@些結(jié)果表明ATO暴露可引起肝臟和空腸炎癥和細(xì)胞凋亡，間接腸肝軸通路可能在ATO誘導(dǎo)肝毒性的潛在機(jī)制中起重要作用
研究背景
砷廣泛分布于農(nóng)業(yè)土壤和地下水中，在全球許多地區(qū)，土壤和河水中的砷濃度超過(guò)了世界衛(wèi)生組織規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)限值（<10?μg/L）。據(jù)報(bào)道，在一些亞洲國(guó)家，飲用水中的砷含量已達(dá)到?150-440?微克/升。由于砷在土壤/植物/動(dòng)物-人類(lèi)食物鏈中的運(yùn)輸和積累，砷暴露變得越來(lái)越普遍。大約?80%?的無(wú)機(jī)砷在攝入后被胃腸道吸收。近幾十年來(lái)，許多報(bào)告描述了砷誘導(dǎo)的動(dòng)物免疫毒性、腎毒性、生殖毒性和其他不良反應(yīng)。此外，近期關(guān)于砷毒性的其他研究表明，砷暴露可通過(guò)氧化損傷引起雞的肝毒性和腸道毒性，但很少有重點(diǎn)研究砷對(duì)水禽腸道和肝臟的影響。鴨子是人類(lèi)飲食中的重要成分和蛋白質(zhì)來(lái)源，然而，由于受砷污染的水和飲食攝入，水禽比其他家禽更容易受到砷毒性的影響，這可能導(dǎo)致人類(lèi)食用的農(nóng)產(chǎn)品（例如鴨肉和雞蛋）中存在砷殘留。因此，研究鴨在砷暴露期間腸道和肝臟的變化尤為重要。
腸道是營(yíng)養(yǎng)消化和吸收的主要器官，腸道微生物對(duì)免疫調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)消化和吸收以及宿主對(duì)病原體的防御至關(guān)重要。在正常生理?xiàng)l件下，腸黏膜免疫、上皮細(xì)胞完整性以及腸道微生物群與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用維持腸道環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，重金屬暴露對(duì)腸道功能有不利影響。據(jù)報(bào)道，鎘可通過(guò)增加小鼠腸道通透性和降低腸道微生物豐富度來(lái)?yè)p害腸道組織。此外，另一項(xiàng)研究表明，銅暴露顯著影響鯉魚(yú)肝功能的生化指標(biāo)，并抑制腸上皮緊密連接蛋白（ZO-1?和?Occludin）的表達(dá)。這些研究表明，重金屬暴露會(huì)干擾腸道微生物群，從而導(dǎo)致代謝紊亂并增加腸炎和脂肪肝等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
肝臟是腸道微生物及其產(chǎn)物易位的第一個(gè)目標(biāo)。因此，腸肝軸在肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要意義。研究表明，腸道菌群可通過(guò)增加脂多糖（LPS）誘導(dǎo)肝損傷，主要通過(guò)激活?TLR4/NF-κB?信號(hào)通路誘導(dǎo)肝臟炎癥和脂質(zhì)積累。此外，腸道屏障破壞引起的腸道通透性增加也可能是肝病發(fā)生的重要因素。值得注意的是，一些研究人員已經(jīng)表明肝臟和腸道炎癥與重金屬暴露密切相關(guān)。最近的一些報(bào)道也表明腸道炎癥的發(fā)生可能與?NLRP3?炎癥小體和?IκB/NF-κB?信號(hào)通路的激活有關(guān)。然而，據(jù)我們所知，砷引起的肝臟和腸道炎癥的激活機(jī)制仍不確定。因此，砷是否通過(guò)激活?NF-κB?信號(hào)通路和?NLRP3?炎癥小體導(dǎo)致鴨腸道損傷，并通過(guò)腸-肝軸激活引起肝臟炎癥和細(xì)胞凋亡需要進(jìn)一步研究。
本研究采用組織病理學(xué)技術(shù)、實(shí)時(shí)定量?PCR、蛋白質(zhì)印跡分析和全長(zhǎng)?16S rRNA?高通量測(cè)序技術(shù)研究砷誘導(dǎo)腸道和肝臟損傷的潛在機(jī)制及其對(duì)鴨腸道微生物組成的影響。本研究的結(jié)果可能有助于更好地了解砷誘導(dǎo)家禽肝臟和腸道毒性的潛在機(jī)制，并為未來(lái)的研究奠定基礎(chǔ)。
研究結(jié)果
ATO?暴露對(duì)空腸組織病理學(xué)的影響
為了評(píng)估對(duì)?ATO?暴露的潛在腸道形態(tài)學(xué)改變，H&E?染色用于檢測(cè)腸道組織病理學(xué)變化，PAS?染色用于檢測(cè)?ATO?對(duì)粘蛋白層和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響。組織病理學(xué)改變（H&E染色）見(jiàn)圖1A，對(duì)照組空腸組織形態(tài)正常，邊界清晰，上皮細(xì)胞排列整齊。然而，用?8 mg/kg ATO?處理的鴨子表現(xiàn)出通過(guò)腸絨毛頂端上皮脫落和絨毛長(zhǎng)度顯著減少的空腸損傷（P < 0.01）。與對(duì)照組相比，隱窩深度（黑色箭頭）沒(méi)有明顯變化（P > 0.05）（圖?1C-D）。PAS?染色產(chǎn)生了類(lèi)似的結(jié)果。如圖1B所示，未處理組的腸黏膜覆蓋著一層厚厚的連續(xù)黏蛋白層和許多紫紅色的杯狀細(xì)胞（紅色箭頭）。然而，暴露于?8 mg/kg ATO?后，粘蛋白層變薄，杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少。此外，與對(duì)照組和?4 mg/kg ATO?組相比，8 mg/kg ATO?治療組的?SIgA?水平也顯著降低（P < 0.05?或?P < 0.01，圖?1E），而?DAO?含量則為隨著?ATO?水平的增加，顯著升高（P < 0.05，圖?1F）。結(jié)果表明，砷會(huì)引起空腸損傷，從而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。
ATO暴露對(duì)空腸和血清砷含量的影響
如圖?1G-H?所示，鴨空腸和血清中砷濃度呈劑量依賴(lài)性增加。與對(duì)照組相比，所有ATO治療組血清和空腸組織中砷含量均顯著升高（P < 0.001）。此外，8 mg/kg ATO?組的砷水平顯著高于?4 mg/kg ATO?治療組（P < 0.01?或?P < 0.001）。
ATO暴露對(duì)腸道屏障功能的影響
為了研究?ATO?暴露是否通過(guò)破壞腸道屏障來(lái)增加組織毒性，我們?cè)u(píng)估了腸道屏障標(biāo)志物。圖?2A-D?顯示了腸道屏障相關(guān)基因和蛋白質(zhì)。與對(duì)照組相比，8 mg/kg ATO組Occludin、ZO-1、Claudin-1和MUC2的mRNA水平顯著下調(diào)（P < 0.05或P < 0.001）。此外，8 mg/kg ATO?組中?Occludin?和?ZO-1?的?mRNA?水平顯著低于?4 mg/kg ATO?組（P < 0.05?或?P < 0.001）。同樣，與對(duì)照組相比，所有?ATO?治療組的?Occludin?蛋白水平顯著降低（P < 0.05?或?P < 0.01）。與對(duì)照組和4 mg/kg ATO組相比，8 mg/kg ATO組的ZO-1蛋白水平也明顯降低（P < 0.001）。同時(shí)，MUC2?抗體的免疫熒光顯示?ATO?降低了鴨空腸組織中的?MUC2?熒光強(qiáng)度（圖?2E-F）。
ATO暴露對(duì)肝臟組織病理學(xué)和生化指標(biāo)的影響
如圖?3A?所示，外觀(guān)學(xué)檢測(cè)顯示?8 mg/kg ATO?組的肝臟表面有許多白色結(jié)節(jié)性病變。同樣，組織病理學(xué)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，8 mg/kg ATO?組的肝臟有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（黑色箭頭）和囊泡脂肪變性（紅色箭頭）（圖?3B）。此外，增加的血清?AST、ALT、TC?和?TG?水平證實(shí)?8 mg/kg ATO?組的鴨有嚴(yán)重的肝損傷和脂肪變性（P < 0.05?或?P < 0.01?或?P < 0.001，圖?3C-F）。值得注意的是，8 mg/kg ATO?治療組的血清?LPS?水平顯著高于對(duì)照組和?4 mg/kg ATO?組（P < 0.01，圖?3G）。
ATO暴露對(duì)腸道菌群多樣性的影響
在目前的微生物多樣性分析中，我們使用?PacBio?平臺(tái)對(duì)八個(gè)腸道內(nèi)容物樣本進(jìn)行全長(zhǎng)?16S rRNA?基因擴(kuò)增，獲得了?102,583?個(gè)原始?CCS?序列（范圍?= 10,078?至?14,498）。剔除低質(zhì)量?CCS?序列后，對(duì)照組和?8 mg/kg ATO?組分別獲得了平均?54,518±747?和?45,050±1675?的高質(zhì)量?CCS?序列。補(bǔ)充表?S2?提供了有關(guān)?CCS?序列的詳細(xì)信息?；?97%?的序列相似性，在兩組中鑒定出?340?個(gè)?OTU，對(duì)照組和?ATO?組分別包含?43?個(gè)和?15?個(gè)獨(dú)特的?OTU（圖?4A）。
α?和?β?多樣性分析都用于評(píng)估對(duì)照組和?ATO?治療組之間腸道細(xì)菌群落多樣性的差異。如圖?4B?所示，NMDS?分析用于分析各組之間的?β-多樣性，ATO?治療組和對(duì)照組之間的腸道微生物群分布分別與每組聚類(lèi)。此外，物種稀釋性曲線(xiàn)趨于相對(duì)平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量和深度符合后續(xù)分析的要求（圖4C）。腸道微生物種群的α多樣性通過(guò)群落豐度（ACE）和多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)）來(lái)反映。與對(duì)照組相比，ATO?暴露顯著降低了?ACE?和香農(nóng)指數(shù)（P < 0.05，圖?4D-E），這表明?ATO?暴露顯著改變了鴨腸道微生物的豐富度和多樣性。
我們進(jìn)一步分析了空腸微生物群在門(mén)、屬和種水平上的變化。在門(mén)水平（圖?4G），Metastats?分析顯示可檢測(cè)門(mén)的豐度在對(duì)照組和?8 mg/kg ATO?組之間沒(méi)有顯著差異。值得注意的是，在誘導(dǎo)?ATO?后，鴨的腸道微生物群落中無(wú)法檢測(cè)到兩種細(xì)菌門(mén)（疣菌門(mén)和酸桿菌門(mén)）。此外，進(jìn)一步使用Metastats分析來(lái)比較兩組之間的屬水平差異。如圖?4F?所示，ATO?暴露顯著降低了?Merdimonas、Blautia、Globicatella、Weissella、消化鏈球菌、Sellimonas?的相對(duì)豐度（P < 0.05）。在物種水平上，從所有樣本中鑒定出?36?個(gè)物種（圖?4I），并且相比于ATO?處理組，?Merdimonas_faecis、Blautia_sp、Eubacterium_ventriosum、Globicatella_sanguinis、Weissella_paramesenteroides?和?Peptostreptococcus_anaerobius?的相對(duì)豐度在對(duì)照組更高?(P < 0.05，圖?4J)。
ATO暴露對(duì)空腸組織NLRP3炎癥小體活化的影響
為了評(píng)估?ATO?誘導(dǎo)的炎癥小體激活是否與腸道損傷有關(guān)，我們檢查了炎癥小體激活標(biāo)志物的表達(dá)水平。從圖?5A?可以看出，NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β?和?IL-18?的?mRNA?表達(dá)水平隨著?ATO?水平的增加而升高，與對(duì)照相比，8 mg/kg ATO?組和?4 mg/kg ATO?組出現(xiàn)顯著差異?（P < 0.05?或?P < 0.01?或?P < 0.001）。同時(shí)，NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β?和?IL-18?的蛋白質(zhì)濃度在?8 mg/kg ATO?組中也顯著增加（P < 0.01?或?P < 0.001，圖?5B-C）。這些基因和蛋白質(zhì)的變化在熱圖中直觀(guān)地顯示出來(lái)（圖?5D）。這些結(jié)果表明，ATO?處理引發(fā)了鴨空腸組織中?NLRP3?炎癥小體的激活和細(xì)凋亡。
ATO暴露對(duì)空腸組織IκB/NF-κB信號(hào)通路的影響
為了進(jìn)一步確認(rèn)?ATO?是否在空腸組織中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過(guò)?qRT-PCR?和蛋白質(zhì)印跡分析確定了空腸組織中?IκB/NF-κB?信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的水平，如圖?6?所示。與對(duì)照組相比，8 mg/kg ATO?治療組中?NF-κB、IFN-γ?和?TNFα?的?mRNA?水平顯著升高，伴隨著?IκB?水平的降低（P < 0.05?或?P < 0.01，圖?2）。6A)。此外，ATO暴露下IFN-γ、TNFα、p-NF-κB/NF-κB和p-IκB/IκB蛋白水平也上調(diào)，8 mg/kg ATO組的變化為與對(duì)照組和?4 mg/kg ATO?組相比最明顯（P < 0.05?或?P < 0.01?或?P < 0.001，圖?6B-C）。這些基因和蛋白質(zhì)的變化通過(guò)熱圖直觀(guān)地顯示出來(lái)（圖?6D）。此外，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，8 mg/kg ATO?處理組的細(xì)胞核中呈陽(yáng)性棕色顆粒，表明?p-NF-κB?在細(xì)胞核中表達(dá)（圖?6E）。這些數(shù)據(jù)表明，8 mg/kg ATO?處理的鴨的空腸組織發(fā)炎，并且?IκB/NF-κB?信號(hào)通路被激活。
ATO?誘導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡
為了進(jìn)一步研究?ATO?暴露對(duì)鴨肝炎癥反應(yīng)的影響，我們檢測(cè)了?TLR4/NF-κB?相關(guān)基因的?mRNA?水平。如圖?7A?所示，與對(duì)照組和?4 mg/kg ATO?組相比，8 mg/kg ATO?組中?TLR4、NF-κB、IFN-γ?和?TNF-α?的?mRNA?水平顯著上調(diào)（?P < 0.05?或?P < 0.01），而?IκB mRNA?水平顯著下調(diào)（P < 0.05）。此外，與對(duì)照組相比，治療組的?TLR4、p-NF-κB/NF-κB、p-IκB/IκB、TNFα?和?IFN-γ?蛋白水平顯著升高（P < 0.05?或?P < 0.01或?P < 0.001；圖?7C, F)。與?4 mg/kg ATO?組相比，8 mg/kg ATO?組的?p-NF-κB/NF-κB?和?IFN-γ?蛋白水平顯著增加（P < 0.05?或?P < 0.01?圖?7C，F(xiàn)）。為了探索?ATO?誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以確定肝損傷是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)。如圖?7B?所示，與對(duì)照組相比，8 mg/kg ATO?暴露后?NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β?和?IL-18?的?mRNA?表達(dá)顯著增強(qiáng)（P < 0.05?或P < 0.01?或?P < 0.001)。類(lèi)似地，與對(duì)照組和?4 mg/kg ATO?組相比，8 mg/kg ATO?治療組的?NLRP3?和?Caspase-1?的蛋白質(zhì)水平顯著增加（P < 0.01?或?P < 0.001；圖?7D-E，G）。此外，與對(duì)照組相比，8 mg/kg ATO?組的?GSDMD、IL-1β?和?IL-18?的蛋白質(zhì)水平顯著增加（P < 0.05?或?P < 0.01；圖?7D-E）。因此，暴露于?8 mg/kg ATO?會(huì)在鴨肝組織中引起顯著的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。
結(jié)論
我們的結(jié)果表明砷暴露會(huì)損害腸道屏障功能并導(dǎo)致鴨空腸炎癥損傷。同時(shí)，過(guò)量的砷可通過(guò)觸發(fā)?LPS/TLR4/NF-κB?信號(hào)通路和?NLRP3?炎癥小體來(lái)誘導(dǎo)肝臟炎癥和細(xì)胞凋亡。腸-肝軸的間接通路可能在?ATO?誘導(dǎo)的肝毒性和腸道毒性的潛在機(jī)制中起重要作用。該研究為水禽過(guò)量砷暴露的毒性研究提供了基礎(chǔ)，并為深入了解砷的毒性機(jī)制提供了依據(jù)。
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