《Mol Plant》泡桐速生及泡桐叢枝病形成的機(jī)理研究-基因組精細(xì)圖叢枝植原體完成圖

近日，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)范國(guó)強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際期刊《Molecular Plant》（IF：13.162）上發(fā)表了題為?“Genomic insights into the fast growth of paulownias and the formation of Paulownia witches’ broom”的研究論文。百邁客生物科技作為共同一作共同參與研究。本研究通過(guò)三代PacBio等技術(shù)繪制白花泡桐基因組精細(xì)圖及泡桐叢枝植原體基因組完成圖，并揭示了白花泡桐速生的關(guān)鍵因素，以及泡桐叢枝病發(fā)生的分子機(jī)制。

研究背景

泡桐（2n=2x=40）是我國(guó)重要的速生用材樹(shù)種之一，在保障我國(guó)木材安全、改善生態(tài)環(huán)境和提高人民生活水平等方面具有重要作用。然而，泡桐的利用和研究還很薄弱。泡桐叢枝(Paulownia witches’ broom；PaWB)植原體是一種專性寄生病原菌，是泡桐屬植物的一種常見(jiàn)病害。植原體感染的泡桐，通常表現(xiàn)出葉片泛黃、植株生長(zhǎng)遲緩以及叢枝等典型癥狀。泡桐及其植原體基因組信息的缺乏嚴(yán)重阻礙了PaWB病理生物學(xué)的闡明。因此，解析其對(duì)應(yīng)參考基因組信息將有助于闡明叢枝病的發(fā)病機(jī)制。

材料與方法

Denovo：

1、白花泡桐（Paulownia fortunei）葉片；89X Illumina+ 87.3X PacBio+ 90X Hi-C

2、PaWB侵染的百花泡桐幼苗（PFI）的莖進(jìn)行DNA分離和PacBio測(cè)序，選取無(wú)法比對(duì)到宿主基因組的Reads用于組裝（泡桐叢枝植原體基因組）

RNA-seq：

1、4年生白花泡桐和毛泡桐樹(shù)的葉片、樹(shù)干形成層和樹(shù)干韌皮部組織，每個(gè)三生物學(xué)重復(fù)。

2、健康幼苗、患病幼苗、MMS或RIF處理5天、20天等天數(shù)的患病幼苗頂芽，每個(gè)三生物學(xué)重復(fù)。

主要研究?jī)?nèi)容

1、白花泡桐基因組組裝注釋

2、白花泡桐系統(tǒng)進(jìn)化與全基因組復(fù)制

3、白花泡桐形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因家族

4、C₃光合作用與景天酸代謝（CAM）相結(jié)合提高白花泡桐的光合效率

5、與泡桐植原體侵染相關(guān)的泡桐基因網(wǎng)絡(luò)模塊

6、PaWB植原體基因組特征及比較基因組分析

7、PaWB-SAP54是PaWB植原體的功能效應(yīng)子

8、PaWB-SAP54通過(guò)介導(dǎo)PfSPLa泛素化誘導(dǎo)PaWB的形成

主要研究結(jié)果

1. 白花泡桐基因組組裝注釋

本次研究的白花泡桐擁有2.03%的高度雜合，以及50%的重復(fù)序列；作者通過(guò)三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)等測(cè)序技術(shù)，最終組裝完成511.6 Mb泡桐基因組（流式預(yù)估528.24 Mb，survey 552 Mb），contigN50=852.4 Kb；并通過(guò)Hi-C技術(shù)將93.2%序列錨定至20條假染色體上。通過(guò)BUSCO評(píng)估（97.45%）、轉(zhuǎn)錄組回比評(píng)估（96.02%）、Hi-C熱圖評(píng)估等結(jié)果表明本次構(gòu)建了高質(zhì)量染色體水平的白花泡桐基因組。

共預(yù)測(cè)31,985個(gè)蛋白編碼基因，重復(fù)元件（257.65 Mb）占基因組的50.34%，以Ty3/gypsy和Ty1/copia的長(zhǎng)末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR-RTs）為主，分別占基因組的15.96%和13.54%。重復(fù)序列動(dòng)態(tài)分析表明，在過(guò)去的800萬(wàn)年中，泡桐沒(méi)有發(fā)生LTR-RT的爆發(fā)事件。轉(zhuǎn)座子（Transposable elements，TEs）在基因組中分布不均，通常傾向于在著絲粒區(qū)積累。對(duì)于17、18號(hào)染色體，TEs在一端聚集，形成端著絲粒染色體（圖1A），這與先前基于核型分析的研究結(jié)果一致。

2. 白花泡桐系統(tǒng)進(jìn)化與全基因組復(fù)制

為了進(jìn)一步明確泡桐的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)與透骨草科、列當(dāng)科、茄科、茜草科以及葡萄科中9個(gè)近緣材料進(jìn)行比較基因組分析。結(jié)果表明，泡桐科在40.92百萬(wàn)年時(shí)從透骨草科和列當(dāng)科最近的共同祖先分化而來(lái)。在泡桐的多拷貝基因家族中，有3022個(gè)家族發(fā)生了擴(kuò)張或收縮，而擴(kuò)張的基因家族涉及與木質(zhì)素和纖維素合成（UDP- forming）相關(guān)的基因家族。

Ks及共線性等分析表明，白花泡桐與溝酸漿（Mimulus guttatus）及芝麻（Sesamum indicum）一致，都發(fā)生過(guò)兩輪全基因組復(fù)制事件。第一輪為共有的γ三倍化事件（約122~164mya的WGT-γ），第二輪為泡桐與芝麻共有的近期二倍化事件。

染色體重建表明，Chr7和Chr11是在最近的WGD之后從染色體融合中衍生出來(lái)的，因?yàn)镃hr17、Chr15和Chr19分別只與葡萄Chr1、Chr18和Chr5保持了祖先的共線性（圖1F）。多對(duì)泡桐染色體表現(xiàn)出相同的融合模式，表明染色體融合發(fā)生在最近的WGD之前：Chr8和Chr14均起源于祖先葡萄Chr9和Chr17的融合，而Chr9和Chr16均起源于祖先葡萄Chr10、Chr12和Chr19的融合。功能富集分析表明，新WGD的基因富集于“鎘離子反應(yīng)”和“細(xì)菌防御”，串聯(lián)重復(fù)的基因富集于“生物刺激反應(yīng)”和“防御反應(yīng)”。這些觀察結(jié)果暗示了基因組/基因復(fù)制在泡桐適應(yīng)環(huán)境變化中的重要作用。

3. 白花泡桐形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因家族

植物的形態(tài)發(fā)生和生長(zhǎng)速率可能歸因于細(xì)胞增殖和分裂、細(xì)胞壁形成以及光合效率或其他生物過(guò)程的增強(qiáng)。細(xì)胞分裂素生物合成中的四個(gè)基因家族和細(xì)胞周期調(diào)控中的十個(gè)基因家族，通過(guò)串聯(lián)基因復(fù)制或最近的WGD發(fā)生顯著擴(kuò)增（圖2A）。在泡桐屬植物中，白花泡桐（PF）的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于毛泡桐（P. tomentosa，?PT）。約85%的毛泡桐基因cDNA可定位于白花泡桐基因組，因此對(duì)白花泡桐和毛泡桐的葉片、樹(shù)干韌皮部和樹(shù)干形成層進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。WGCNA分析得到12個(gè)潛在快速生長(zhǎng)相關(guān)ME（FME1~12），F(xiàn)ME3與毛泡桐和白花泡桐形成層的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)（圖2B）。FME3模塊包括42個(gè)參與植物激素途徑或參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因。FME4僅在白花泡桐中與形成層生長(zhǎng)和發(fā)育高度相關(guān)（圖2B），這個(gè)模塊中有五個(gè)基因與激素信號(hào)有關(guān)，其中包括參與細(xì)胞分裂素代謝的腺苷激酶1，且這些基因在白花泡桐中顯著擴(kuò)增。通過(guò)基因的表達(dá)及拷貝數(shù)分析表明，CESAs、Csls和木質(zhì)素生物合成基因可能在白花泡桐的發(fā)生中起作用（圖2D）。

4. C₃光合作用與景天酸代謝（CAM）相結(jié)合提高白花泡桐的光合效率

較高的光合效率有助于白花泡桐的快速生長(zhǎng)。在隨機(jī)選擇的C₃植物中，白花泡桐的凈光合速率最高且與C₄植物非常接近。通過(guò)Drop-seq分析白花泡桐葉肉細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)參與卡爾文循環(huán)的基因表達(dá)水平較高，表明卡爾文循環(huán)非?；钴S。此外，白花泡桐葉片的碳同位素（δ13C）變化率晝夜差異不顯著。這些觀察結(jié)果為白花泡桐中典型的C₃碳同化提供了有力的證據(jù)。

作者測(cè)試了白花泡桐是否通過(guò)CAM來(lái)固定CO₂（CAM可以通過(guò)補(bǔ)充C₃光合作用來(lái)提高光合速率）。發(fā)現(xiàn)白花泡桐葉片氣孔在白天和晚上均開(kāi)放（圖3A），夜間氣孔開(kāi)放表明CAM通路可能參與了泡桐的二氧化碳固定。較高的CAM途徑關(guān)鍵基因拷貝數(shù)為泡桐中更復(fù)雜的光合類型奠定了基礎(chǔ)。

為了確定CAM通路關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，作者使用上午9:00和晚上9:00采集的白花泡桐葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果表明白花泡桐通過(guò)在夜間補(bǔ)充CAM途徑獲得更高的光合能力，從而有助于泡桐的快速生長(zhǎng)（圖3D、3E）。

5. 與泡桐植原體侵染相關(guān)的泡桐基因網(wǎng)絡(luò)模塊

PaWB植原體感染是泡桐死亡的主要原因之一。作者采用不同濃度的甲磺酸甲酯（MMS）和利福平（RIF）處理PaWB植原體感染的白花泡桐苗（PFI）。對(duì)MMS和RIF處理不同時(shí)間的患病泡桐幼苗進(jìn)行RNA-seq分析，研究泡桐對(duì)PaWB植原體侵染的響應(yīng)。WGCNA分析鑒定出27個(gè)不同的PaWB相關(guān)模塊特征基因（PME1~27）（圖4A）。這些模塊包含參與光合作用、細(xì)胞運(yùn)輸和離子穩(wěn)態(tài)、植物生長(zhǎng)發(fā)育、防御、以及轉(zhuǎn)錄有關(guān)的hub基因（圖4B ，4C）。

6. PaWB植原體基因組特征及比較基因組分析

為了進(jìn)一步了解植原體與泡桐相互作用的分子機(jī)制，作者對(duì)PaWB植原體基因組進(jìn)行了測(cè)序和組裝。組裝的叢枝植原體核基因組大小為891,641 bp，有1,147個(gè)開(kāi)放閱讀框、32個(gè)tRNAs和4個(gè)可移動(dòng)元件（PMUs），PMUs在植原體基因組的重組和植原體在宿主體內(nèi)的適應(yīng)性中起著重要的作用。

與另外七個(gè)植原體基因組進(jìn)行比較（來(lái)自基于16srRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的I、V、X和XII分支）。通過(guò)單拷貝核心基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化關(guān)系與16srRNA的結(jié)果基本一致， PaWB植原體與洋蔥黃化植原體（OY-M）的關(guān)系更為密切（圖5C）。隨著系統(tǒng)發(fā)育距離的增加，PaWB植原體與其他植原體之間的基因組同源性大大降低，表明基因組重排的頻率很高。

為了深入了解對(duì)植原體感染非常重要的代謝途徑的差異，作者分析了甘油磷脂、糖酵解、嘧啶和葉酸代謝中基因的存在和缺失。只有PaWB植原體和OY-M具有完整的葉酸生物合成途徑，而其他植原體缺乏這四個(gè)基因的部分或全部。

7. PaWB-SAP54是PaWB植原體的功能效應(yīng)子

泡桐叢枝植原體含有73個(gè)效應(yīng)因子，其中11個(gè)效應(yīng)因子可能與叢枝病的發(fā)生密切相關(guān)。為了研究PaWB-SAP54在PaWB植原體侵染過(guò)程中的作用，作者利用根癌農(nóng)桿菌將PaWB-SAP54基因?qū)朊麠睢Ｅc野生型相比，轉(zhuǎn)基因毛果楊表現(xiàn)出分枝增多，且PaWB-SAP54的轉(zhuǎn)錄水平增加了4.7-5.3倍（圖6A）。轉(zhuǎn)基因毛果楊在較細(xì)的莖上有二級(jí)分枝，而在野生型中沒(méi)有觀察到分枝（圖6B）。表明PaWB-SAP54介導(dǎo)了叢枝癥狀的形成。

8. PaWB-SAP54通過(guò)介導(dǎo)PfSPLa泛素化誘導(dǎo)PaWB的形成

為了探討PaWB-SAP54在PaWB形成過(guò)程中的分子機(jī)制，作者采用酵母雙雜交（Y2H）技術(shù)篩選了PaWB-SAP54蛋白的潛在結(jié)合蛋白。共發(fā)現(xiàn)112個(gè)泡桐蛋白與PaWB-SAP54相互作用，其中鑒定出的鱗狀啟動(dòng)子結(jié)合蛋白a（PfSPLa）（圖6C）是AtSPL9和AtSPL15的同源物，這兩種蛋白都對(duì)腋芽的形成和分枝發(fā)育有負(fù)調(diào)控作用。在PaWB植原體感染的幼苗中，PfSPLa的蛋白質(zhì)豐度顯著降低（圖6D）。由于泛素化參與了叢枝病的形成，因此作者研究了PfSPLa是否直接受泛素降解途徑的調(diào)控。用26S蛋白酶體抑制劑環(huán)氧霉素處理感染的幼苗后，PfSPLa的表達(dá)增加（圖6D），并通過(guò)westernblot分析直接證實(shí)PfSPLa的泛素化（圖6E）。以PfSPLa蛋白為誘餌的Y2H篩選表明，PfSPLa可直接與多聚泛素和26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基3（PfRPN3）相互作用（圖6F）。雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)這種相互作用。用PfSPLa-RNAi構(gòu)建轉(zhuǎn)基因毛果楊，發(fā)現(xiàn)3個(gè)與PfSPLa同源的基因表達(dá)下調(diào)，也引起毛果楊分枝表型的發(fā)生（圖6G-6I）。并且RNAi植物表現(xiàn)出矮化表型（圖6H）。這些結(jié)果表明，PaWB-SAP54可能與PfSPLa相互作用，進(jìn)而以泛素/26S蛋白酶體依賴的方式促進(jìn)PfSPLa的降解，最終誘發(fā)泡桐叢枝病。

植物激素的定量顯示，轉(zhuǎn)基因植株中赤霉素、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素含量有顯著變化（圖6J）。結(jié)果表明，PfSPLa通過(guò)控制激素水平來(lái)調(diào)節(jié)分枝的形成。

小結(jié)

本研究通過(guò)白花泡桐及其叢枝植原體基因組測(cè)序和進(jìn)化分析，揭示了C₃光合作用與景天酸代謝相結(jié)合提高光合效率的方式，是白花泡桐快速生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。并通過(guò)WGCNA、轉(zhuǎn)基因、酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀等方式，闡明了泡桐叢枝植原體效應(yīng)因子PaWB-SAP54介導(dǎo)的PfSPLa泛素化引起了泡桐叢枝病的形成。該研究為加速泡桐的分子育種、品種改良及進(jìn)一步闡明泡桐叢枝病發(fā)生分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。