導讀
研究背景：
宮頸癌是全球女性癌癥相關死亡的第四大原因。全世界每年報告的新病例超過500000例（Torre等人，2015年）。盡管目前可用的治療方法，如化療、根治性子宮切除術和放療，顯示出有希望的結果，但由于此類治療的強烈副作用，每年還是大約有30萬人死亡（Franco等人，2001年）。
因此，迫切需要探索能夠有效治療宮頸癌且副作用最小的新分子（Smith等人，2007）。
莎草L.（莎草科），已被證明具有廣泛的生物和藥理功能，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗雄激素、抗癌、抗驚厥、抗糖尿病和止瀉活性（Kamala et al.，2018；Pirzada et al.，2015）。香附子的主要活性成分是揮發(fā)油，包括多種單萜、倍半萜和氧化物。α-Cyperone是香附子根莖中主要的天然倍半萜之一，約占總揮發(fā)油的20%（Soumaya-Kilani et al.，2008）。體外實驗表明，α-Cyperone具有抗炎作用（Hu等人，2017）。在LPS刺激的RAW 264.7細胞中，α-Cyperone通過NF-κB信號通路的負調控抑制促炎因子COX-2和IL-6的表達（Jung等人，2013）。巧合的是，α-Cyperone通過激活Akt/Nrf2/HO-1和抑制神經調節(jié)的NF-κB信號通路來抑制LPS誘導的BV-2細胞的炎癥（Huang等人，2018）。
考慮到香附子在中藥中常用于治療婦科疾?。≒aula et al.，2011），而α-Cyperone是香附子中最有前景的活性成分（Huang et al.，2018；Jung et al。2013），作者推測α-Cyperone可能在宮頸癌的防治中發(fā)揮重要作用。本研究旨在檢測α-Cyperone對HeLa細胞是否具有抗腫瘤活性，并探討其作用機制。
結論
結果表明，α-Cyperone能抑制HeLa細胞的增殖并誘導其凋亡。從機制上講，α-Cyperone通過線粒體凋亡途徑促進HeLa細胞凋亡，細胞內活性氧（ROS）水平升高，細胞色素c、半胱氨酸蛋白酶-3、PARP和Bax的表達上調。進一步的RNA測序顯示α-Cyperone抑制HeLa細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，PI3K抑制劑和激動劑證實了這一點。PI3K抑制劑（LY294002）與α-Cyperone協(xié)同抑制HeLa細胞的生長，而PI3K激動劑（IGF-1）則消除了這種作用。有趣的是，α-Cyperone和LY294002均能抑制PD-L1的表達，而IGF-1的補充則能挽救PD-L1的低表達。綜上所述，作者的研究結果揭示了α-Cyperone對HeLa細胞生長的抑制作用是通過ROS介導的PI3K/Akt/mTOR信號通路觸發(fā)的，并且與PD-L1表達的下降密切相關。
英文題目：α-Cyperone inhibits the proliferation of human cervical cancer HeLa cells via ROS-mediated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.
期刊雜志：European Journal of Pharmacology
影響因子：3.623
原文鏈接：https://sci-hub.ren/10.1016/j.ejphar.2020.173355
材料與方法
材料：人宮頸癌細胞HeLa；
Keywords：RNA-seq；
實驗結果
一、α-Cyperone抑制HeLa細胞增殖和抑制既落形成
用CCK-8法檢測α-Cyperone對HeLa細胞體外活力的影響。在指定的時間（24、48和72小時）使用不同濃度的α-Cyperone處理HeLa細胞。如圖1A所示，α-Cyperone對HeLa細胞增殖具有濃度和時間依賴性抑制作用。細胞毒作用48h的半數(shù)抑制濃度（IC50）值HeLa細胞為35.57±1.58μM。因此，作者在進一步的實驗中選擇了15、30和60μM的α-Cyperone。
在平板克隆形成試驗中，與未經處理的對照組相比，經不同濃度（15、30和60μM）的α- Cyperone處理的HeLa細胞形成的集落更少且更小，這表明α- Cyperone以劑量依賴性方式降低HeLa細胞的集落形成能力（圖1B）
圖1
二、α-Cyperone誘導G1細胞周期阻滯
為了研究α-Cyperone是否抑制HeLa細胞的細胞周期進程，作者用不同濃度（0、15、30和60μM）的α-Cyperone處理細胞24小時，然后收集細胞進行細胞周期分析。結果表明，α-Cyperone處理使G1期細胞百分率增加，G1期細胞百分率分別增加6.17%、15.20%和21.30%（圖2A）。采用westernblot檢測cdc25A、cyclind1、CDK6、PCNA、p21和p27的表達水平，進一步探討α-Cyperone對G1細胞周期阻滯的作用機制。作者發(fā)現(xiàn)α-Cyperone下調cdc25A、cyclind1、CDK6和PCNA蛋白水平，同時上調p21和p27蛋白表達（圖2B）。
這些結果表明α-Cyperone誘導HeLa細胞G1細胞周期阻滯。
圖2
三、α-Cyperone通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡
采用hoechst 33342染色法研究α-Cyperone對HeLa細胞凋亡的影響。如圖3A所示，HeLa細胞呈現(xiàn)明亮的藍色熒光，表明細胞核凝聚和DNA斷裂。此外，annexin V/PI染色顯示α-Cyperone以濃度依賴性方式將凋亡細胞百分比從5.64%增加到38.28%（圖3B）。
線粒體膜電位的變化是細胞凋亡的典型事件（Suhaili et al.，2017）。在細胞凋亡過程中，線粒體膜被破壞，線粒體膜電位去極化，這可以通過降低JC-1實驗中紅綠色熒光強度比來衡量。如圖3C所示，α-Cyperone誘導線粒體膜電位的劑量依賴性喪失。為了進一步證實凋亡細胞的死亡，作者檢測了細胞色素c、半胱氨酸蛋白酶-3、Bax、Bcl-2和PARP的蛋白表達。如圖3D所示，α-Cyperone處理顯著增加細胞色素c、caspase-3、PARP和Bax的表達。相反，Bcl-2表達降低。這些結果表明α-Cyperone通過線粒體凋亡途徑誘導HeLa細胞凋亡。
圖3
四、α-Cyperone誘導HeLa細胞氧化應激
如圖4A所示，在濃度分別為15、30和60μM的α-Cyperone作用48小時后，Hela細胞產生的細胞ROS分別增加到30.12%、37.30%和94.67%。然后，作者進一步確定ROS抑制劑（N-乙酰半胱氨酸，NAC）預處理是否能保護HeLa細胞免受α-Cyperone的細胞毒作用。如4B所示，與α-Cyperone單獨治療組相比，NAC和α-Cyperone聯(lián)合治療可顯著降低細胞色素c、Bax的表達，增加PCNA和Bcl-2的表達。結果表明，α-Cyperone誘導HeLa細胞生長抑制是通過破壞氧代謝平衡實現(xiàn)的。
圖4
五、α-Cyperone抑制HeLa細胞PI3K/Akt/mTOR通路的激活
作者對HeLa細胞進行RNA測序分析。根據(jù)結果，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，有656個顯著上調基因和997個下調基因（圖5A）。接下來，通過功能注釋對這些差異基因進行聚類分析。結果表明，α-Cyperone影響了與癌癥相關的多種生物途徑，包括代謝途徑、MAPK信號途徑、PI3K/Akt/mTOR信號途徑、細胞周期和凋亡（圖5B，C）。
為了揭示α-Cyperone對HeLa細胞的抑制作用機制，作者通過westernblot評估了參與PI3K/Akt/mTOR通路的關鍵因子的磷酸化（圖5D）。結果表明，與正常組相比，α-Cyperone作用48h后，HeLa細胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平明顯下調。此外，還利用PI3K抑制劑（LY294002）和PI3K激動劑（IGF-1）進一步探討了α-Cyperone（30μM）對HeLa細胞的作用。如圖5E所示，LY294002（10μM）通過下調Bcl-2、caspase3、PCNA、p-Akt、p-PI3K和p-mTOR的蛋白水平來增強α-Cyperone誘導的細胞凋亡，與Bax和細胞色素c蛋白的上調一致。此外，IGF-1（100 ng/ml）減弱α-Cyperone誘導的細胞凋亡。
也就是說α-Cyperone通過PI3K/Akt/mTOR途徑抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。
圖5
許多研究表明，腫瘤細胞通過利用免疫檢查點逃避宿主免疫監(jiān)視，從而導致癌癥的擴散、轉移和復發(fā)（Pardoll，2012）。免疫檢查點抑制劑（ICIs）主要通過阻斷PD-1和PD-L1的結合來實現(xiàn)抗腫瘤作用（Brahmer等人，2012年）。作者的結果發(fā)現(xiàn)α-Cyperone抑制HeLa細胞中PD-L1的活化（圖5D）。鑒于α-Cyperone抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，作者進一步探討了PD-L1與PI3K/Akt/mTOR信號通路的關系。結果顯示，PI3K抑制劑（LY294002）抑制PD-L1的表達，而PI3K激動劑（IGF-1）增強PD-L1的表達（圖5E）。因此，α-Cyperone通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制PD-L1的表達。
總結
本研究表明α-Cyperone通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對HeLa細胞的生長具有強烈的抑制作用。此外，α-Cyperone通過同樣的途徑抑制PD-L1的表達水平。這些發(fā)現(xiàn)揭示了α-Cyperone抗宮頸癌的機制，提示α-Cyperone的抗腫瘤活性可能與調節(jié)程序性細胞死亡配體1（PD-L1）有關?；谶@些結果，α-Cyperone有望成為治療宮頸癌的候選藥物。
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