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發(fā)布于 2021年4月22日

為什么要做調(diào)研圖

基因組測序現(xiàn)在已經(jīng)成為生物學(xué)研究的一個重要手段，基因組的雜合度和重復(fù)序列對后續(xù)基因組組裝有很大的影響。高雜合的基因組往往無法合并姊妹染色體，導(dǎo)致組裝的結(jié)果偏大，而重復(fù)序列在組裝中會被折疊，使組裝中出現(xiàn)缺口、錯誤，導(dǎo)致組裝的結(jié)果偏小。不同的生物體的基因組之間雜合率和重復(fù)序列含量差異巨大，因此在進行基因組測序前往往需要對基因組的特征進行調(diào)研，以確定測序方案，周期等。目前常用的調(diào)研手段有三種：

用流式細胞儀測定細胞核內(nèi)的DNA總量
用核型分析方法，識別染色體數(shù)量、倍性
用調(diào)研圖，通過二代測序，估算基因組大小、雜合度、重復(fù)序列比例、GC含量等。

不同的技術(shù)手段有不同的側(cè)重，其中調(diào)研圖以低成本，低難度和更多的評估內(nèi)容成為使用最多的技術(shù)手段，同時調(diào)研圖所測的二代數(shù)據(jù)還可以用于回比基因組，以評估組裝質(zhì)量。

調(diào)研圖是基于數(shù)學(xué)統(tǒng)計學(xué)手段獲取物種信息的方式，因此對于已經(jīng)研究的較為清晰的物種——主要是普通二倍體和簡單多倍體，其染色體條數(shù)、倍性、大概基因組大小是已知的，此時僅選擇調(diào)研圖就足以滿足了解基因組特征的需要，但對于多倍體復(fù)雜基因組更推薦補充核型分析和流式的結(jié)果，以和調(diào)研圖相互印證補充。

調(diào)研圖原理(以二倍體調(diào)研圖為例)

評估基因組大小

調(diào)研圖最重要的用處是對基因組的大小進行估計。，對于沒有測序錯誤的理想情況下，用測序數(shù)據(jù)估算基因組大小可以按照這個公式：基因組大小=測序量/reads平均覆蓋深度。但由于測序錯誤的存在，較長的reads非常容易受到錯誤的影響，而將reads切碎為“長度為k的片段”，即k-mer，能大大減輕這個問題，因此調(diào)研圖繪制的是k-mer的深度-頻率分布圖。此時估算基因組大小的公式就變成了：基因組大小=正常kmer數(shù)量/k-mer平均覆蓋深度。因為錯誤總是隨機出現(xiàn)的，所以這里正常的k-mer數(shù)是過濾掉過低頻率的k-mer(即錯誤)后得到的數(shù)量。

在理想狀態(tài)下，K-mer曲線服從泊松分布，即只會出現(xiàn)一個明顯的主峰。但對于一個雜合二倍體，主峰前1/2出會出現(xiàn)一個雜合峰，在雜合度較高的時候可能出現(xiàn)高過主峰的情況。下圖即為一個高雜合二倍體kmer的頻率-深度分布圖。主峰后二倍位置內(nèi)的峰為重復(fù)峰。但如果雜合度很低，可能分布圖中只有一個峰存在。主峰所代表的就是k-mer平均覆蓋深度，用主峰深度代替公式中的k-mer平均覆蓋深度即可算得該基因組的大小。

Figure 1，一個二倍體的kmer頻率-深度分布圖，橫軸為深度，縱軸為kmer出現(xiàn)的頻率，主峰位于深度100左右，雜合峰位于深度50左右

k-mer也并不是切的越小越好，過短的k-mer將無法保證多數(shù)k-mer在基因組中只出現(xiàn)一次，導(dǎo)致主峰深度估計偏大，而較長的k-mer具有跨越更長重復(fù)片段的能力，因此k-mer的選擇其實是一個平衡錯誤和重復(fù)的過程。通常k的選擇為15到21的奇數(shù)，既能夠保證k-mer的種類能覆蓋基因組，又足夠小以避免錯誤的影響。基因組中往往還存在一些重復(fù)序列，這些重復(fù)序列也會引起kmer的重復(fù)，但這些重復(fù)的存在雖然會削低主峰的高度，卻不會改變主峰的位置，上圖主峰后的小峰即為重復(fù)峰。

評估雜合率和重復(fù)序列

前面已經(jīng)提到了雜合率的高低對基因組的組裝有非常大的影響，那么如何計算基因組的雜合率和重復(fù)率呢？通常有兩種不同的方法，一種是直接計算峰的面積，即上圖中雜合峰和重復(fù)峰的面積占總面積的比例，從而估算出雜合率和重復(fù)率。另一種是通過模型擬合各個峰。

genomescope2¹就是一個通過負二項分布擬合基因組k-mer分布來評估基因組特征的工具，其結(jié)果被普遍認可。以下圖為例，一個二倍體的genomeScope分析結(jié)果。

藍色柱子是kmer的觀測值；
橙紅色擬合線部分對應(yīng)著深度過低的kmer，這些kmer被認為是測序錯誤引入的；
黑色擬合線是除去被認為是錯誤的部分（橙紅色擬合線部分）之后剩下的所有k-mer，這些被認為是可靠的kmer數(shù)據(jù)；
黃色擬合線被認為來自基因組非重復(fù)區(qū)域的K-mer分布；
垂直的黑色虛線為預(yù)測最低深度峰的整數(shù)倍覆蓋度；

Figure 2一個二倍體的調(diào)研圖，橫軸是測序深度(覆蓋度)，縱軸是k-mer出現(xiàn)的頻率，主峰位于100左右。

多倍體調(diào)研圖

多倍體又分為異源多倍體和同源多倍體，其調(diào)研圖的情況更為復(fù)雜。以四倍體為例，異源四倍體又被稱為雙二倍體，從k-mer分析的角度來說，其調(diào)研圖和二倍體并無太大差異。雖然如此，他們的染色體之間仍然存在一定的相似性，所以在主峰二倍的位置上往往存在一個小的凸起，這樣的凸起和高重復(fù)率的二倍體調(diào)研圖非常接近。如下圖是一個異源四倍體的調(diào)研圖：

Figure 3一個異源四倍體的調(diào)研圖，主峰位于212深度，三個峰的比例為1:2:4

同源四倍體的兩套亞基因組之間的區(qū)別比異源四倍體更為接近，體現(xiàn)在調(diào)研圖上就是在主峰的二倍位置處有一個明顯隆起的峰。如果存在一定的雜合率，調(diào)研圖上就會存在三個比例為1:2:4的峰，但如果基因組的雜合率很低，雜合峰不明顯，此時調(diào)研圖看起來和二倍體仍然非常接近。

不同的倍性對整套基因組的大小影響不大，所以面對多倍體時，調(diào)研圖的結(jié)果盡量同時結(jié)合流式細胞儀或者核型來判斷。對于雜合率約在0.5%~20%左右，重復(fù)序列不超過約40%的物種，也可以利用smudgeplot軟件¹對雜合k-mer進行分析，得到可能的物種倍性，從而輔助基因組雜合率和重復(fù)序列的估計。

Smudgeplot通過尋找雜合k-mer來研究基因組的倍性，其定義的雜合k-mer對指的是一對k-mer之間只相差一個堿基，且沒有第三個k-mer與他們再相差一個堿基(如ATGATCA, ATGCTCA, ATGGTCA)。對于一個AB形式的雜合，smudgeplot試圖從所有k-mer中尋找一對雜合k-mer，而對于一個AAB形式的雜合，smudgeplot試圖尋找兩條相同的k-mer和一條它們的雜合k-mer，在圖中表示為更高的亮度。如下圖對一個四倍體的smudgeplot分析，可以明顯的看出AABB雜合模式附近的k-mer數(shù)量明顯高于其它k-mer，左上角也描述了這個結(jié)果。

Figure 4一個四倍體的smudgeplot分析結(jié)果，橫軸是雜合k-mer對的深度占總深度的比例，縱軸是所有k-mer對的總深度，二者的交點即代表了不同的雜合結(jié)構(gòu)。交點的亮度代表了落入其中的k-mer數(shù)。

需要注意的是，調(diào)研圖一般需要50x以上的數(shù)據(jù)對基因組進行評估，在測序深度不足的情況下，調(diào)研圖可能無法很好的形成真正意義上的峰，此時好的選擇是加測數(shù)據(jù)，重新繪制調(diào)研圖進行評估。

[1] ?Ranallo-Benavidez, T.R., Jaron, K.S. & Schatz, M.C. GenomeScope 2.0 and Smudgeplot for reference-free profiling of polyploid genomes. Nat Commun?11,?1432 (2020).