單細(xì)胞多組學(xué)占領(lǐng)高分“陣地”- 人動脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)錄和表觀基因組特征

為了研究人類動脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對18例患者(男性77%)的頸動脈內(nèi)膜切除組織進(jìn)行了酶消化，通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS；圖1A)分離出活的有核細(xì)胞，并制備了scRNA-seq文庫。在根據(jù)報告基因的數(shù)量過濾細(xì)胞后，我們對3282個細(xì)胞進(jìn)行了無偏聚類，確定了14個細(xì)胞群體(圖1B和1C)。我們的scRNA-seq數(shù)據(jù)與大量RNA-seq數(shù)據(jù)的相關(guān)性，以及患者間群集分布的變異，證實(shí)了數(shù)據(jù)的一致性，但患者1除外。

我們觀察到3個非免疫細(xì)胞簇(簇8，9和10；表達(dá)CD34和ACTA2[肌動蛋白α2，平滑肌])和11個白細(xì)胞簇(圖1B和1D)。后者包括5個淋巴細(xì)胞簇(第0、1、3、4、11簇；表達(dá)CD3E、CD4、CD8、CD79A)，5個髓系簇(第5、6、7、12和13簇；表達(dá)CD14、CD68、KIT)，和1個沒有明確的細(xì)胞類型表達(dá)譜的混合細(xì)胞的簇(第2簇)，但與其他簇有相似的基因表達(dá)，似乎主要含有凋亡的髓系細(xì)胞和T細(xì)胞(圖1B和1D)。T細(xì)胞是我們數(shù)據(jù)集中豐富的群體，占所有分析細(xì)胞的52.4%，而髓系群體占所有細(xì)胞的18.5%。

圖1

對ECs群集進(jìn)行分離和重新聚類后，發(fā)現(xiàn)了4個不同的子類(E.0-E.3，圖2A)。我們通過標(biāo)記基因?qū)C表型分為不同的亞類(圖2B)。在E0小鼠中，ACKR1有明顯的表達(dá)，ACKR1與靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管相關(guān)，PRCP參與了血管生成和受損內(nèi)皮細(xì)胞的再生(圖2B和2C)。E.1表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)基因，E.2表達(dá)細(xì)胞遷移標(biāo)記FGF18和HEG1，這兩個群體都表達(dá)VCAM1，它在激活的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞(如單核細(xì)胞和T細(xì)胞)的黏附和遷移(圖2C)。這表明E.0、E.1和E.2代表著激活的內(nèi)皮細(xì)胞，它通過細(xì)胞黏附和新生血管以及介導(dǎo)白細(xì)胞外滲，積極活躍地加重晚期病變的炎癥。值得注意的是，E.3亞群表達(dá)典型的SMC標(biāo)記物，如ACTA2、NOTCH3和MYH11 (圖2C)。

EC簇之間的聚集以及SMC相關(guān)通路的富集(圖2D)，表明這個亞群可能正在經(jīng)歷內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，或者反之亦然。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，我們觀察了ACTA2和CD34在連續(xù)的組織學(xué)切片上的表達(dá)(圖2E)。

圖2

第8簇代表SMCs，分為2個亞類：一簇具有收縮特性的SMC(簇S.1；表達(dá)MYH11、ACTA2和TAGLN)和一簇合成型的SMCs(簇S.0；表達(dá)COL1A1、MGP和COL3A1。S0簇中典型的SMC標(biāo)志物的低表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)基因的上調(diào)表明，這些細(xì)胞一部分來自斑塊已建立的帽狀部分。這一簇中的有限數(shù)量的細(xì)胞是KLF4⁺，這表明血管平滑肌細(xì)胞分化為合成的或巨噬細(xì)胞樣表型。

為了更詳細(xì)地定義T細(xì)胞，我們分離和重新聚類CD4⁺T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了5個亞類(CD4.0-CD4.4，圖3A)，其中主要的區(qū)別是它們的激活狀態(tài)，而不是通常用于定義CD4⁺T輔助亞群的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子(圖3B和3C)。CD4.0和CD4.1具有細(xì)胞毒基因表達(dá)譜，此外，這一簇中的基因表達(dá)證實(shí)了與適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)的促炎通路的富集（圖3D)。

根據(jù)經(jīng)典標(biāo)記物FOXP3(轉(zhuǎn)錄因子P3)、IL2RA(CD25)和CTLA4的表達(dá)(圖3B)，最終的CD4⁺亞類(CD4.3)被鑒定為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞簇。對CD8⁺T細(xì)胞的分析揭示了3個亞類，它們與由激活狀態(tài)不同定義的CD4⁺T細(xì)胞相似。這表明最近T細(xì)胞受體(TCR)被激活，表明CD8⁺T細(xì)胞亞群對斑塊特異性抗原有反應(yīng)，可能與動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制更相關(guān)。

圖3

我們分離和重新聚類動脈粥樣硬化性髓系細(xì)胞，揭示了5種不同的表型(My.0-My.4，圖4A)。My.0、My.1和My.2很可能代表不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞。促炎標(biāo)志物基因(圖4B)以及免疫和炎癥通路的富集結(jié)果(圖4C)表明，My.0和My.1亞類由促炎巨噬細(xì)胞組成。My.0顯示了最近招募的巨噬細(xì)胞的特征(圖4C，D)，表明共表達(dá)的炎癥體被激活(圖4B)。與My.0和My.1相比，My.2缺乏明顯的促炎標(biāo)志物，并顯示巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的跡象。

為了進(jìn)一步確定這3個亞類的特征，我們接下來通過獨(dú)創(chuàng)性的通路分析(圖4E)研究了每個群體差異富集的通路(圖4D)，以及可能管理這些群體的上游調(diào)節(jié)因子。My.0和My.1顯示典型炎癥和免疫通路的富集，清楚地表明細(xì)胞激活、募集和免疫細(xì)胞相互作用驅(qū)動了它們的表型。同時預(yù)測My.0和My.1主要受促炎因子控制，如IL1A、干擾素(干擾素)A、IFNG和IL1B。

總之，這證實(shí)了我們分別為My.0和My.1定義的最近遷移和嵌入的炎癥表型，并與我們在My.2中看到的泡沫表型相匹配。它還展示了人類患者和小鼠模型在細(xì)胞類型多樣性方面的良好一致性。

圖4

接下來，我們基于CellPhone?DB v2.0檢查了不同細(xì)胞類型之間潛在的配體-受體相互作用，以預(yù)測病變內(nèi)的細(xì)胞間通訊。淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞的潛在相互作用的絕對數(shù)低，而髓系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的相互作用的絕對數(shù)高(圖5A)。

隨后，我們按髓系配體(圖5B)和受體(圖5C)明確地檢查了髓系群體中獨(dú)特的相互作用。發(fā)現(xiàn)了多種趨化作用，包括內(nèi)皮ACKR1與髓系來源的CCL2、CXCL8、CCL8和CXCL1的相互作用，其中最后兩個配體在My.1中特異性表達(dá)。我們還觀察到在所有髓系亞群中的CSF1R，與在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肥大細(xì)胞和髓系細(xì)胞中的CSF1有相互作用。

圖5

利用scATAC-seq，我們檢測了人類斑塊中髓系和T細(xì)胞的開放染色質(zhì)啟動子和增強(qiáng)子圖譜。我們用scATACseq鑒定了4個髓系細(xì)胞簇和5個T細(xì)胞簇 (圖6A和6B)。巨噬細(xì)胞(CSF1R，IL1B)和T細(xì)胞特異性基因(NKG7)的開放染色質(zhì)，以及巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞(SPI155和ETS156)的細(xì)胞型TFs的motif的富集，明確了細(xì)胞類型之間的劃分界限(圖6C和6D)。轉(zhuǎn)移的髓系群體被重新聚類，類似于scRNA-seq簇(圖6E)。

IRF4已被證明是CD1c⁺樹突狀細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其motif確實(shí)在My.3中富集(圖6F)。與scRNA-seq數(shù)據(jù)一致，My.1顯示了促炎因子motif的富集(圖6F)，這與在這些細(xì)胞中看到的促炎基因表達(dá)相匹配。在scATAC-seq數(shù)據(jù)中，My.0細(xì)胞特異性地富含NFATC3 的motif(圖6F)，這是一種先前被認(rèn)為與激活的TLR通路信號有關(guān)的TF。My.2細(xì)胞富含抗炎的泡沫細(xì)胞相關(guān)的TFs，這和scRNA數(shù)據(jù)中是相似的。

我們觀察到含有KLF4的motif位點(diǎn)的染色質(zhì)可及性增加，被證明實(shí)現(xiàn)了抗炎巨噬細(xì)胞激活狀態(tài)，并參與血管平滑肌細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(圖6F)。

圖6

我們將317個CAD相關(guān)的基因與3876個差異表達(dá)基因進(jìn)行了交集，共有74個基因。同時觀察到GWA的連鎖基因在3、8和14模式中顯著積累(圖7B)。模式3中的基因與EC簇9和10中的高表達(dá)相關(guān)(圖7C)，模式8的特點(diǎn)是有與4個巨噬細(xì)胞群相關(guān)的基因表達(dá)(圖7A)，包含AMPD2、CTSS、IL6R、CAPG、GPX1、GNAI2、TRIB1、SH2B3、FES、C19orf38和Vasp(圖7B和7D)。模式14中基因的高表達(dá)主要與平滑肌細(xì)胞群8和CD34⁺EC第10簇群體相關(guān)(圖7E)。我們的結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是功能測試的出發(fā)點(diǎn)。

?圖7