【16S V4 16S全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序】-完整的腸道微生物群可以保護(hù)遺傳易感小鼠免受白血病的侵襲

為了研究腸道微生物群在Pax5+/-小鼠PB-ALL發(fā)育中的作用，我們建立了一個(gè)由24只對(duì)照仔鼠野生型(WT)和24只Pax5+/-雌性小鼠組成的小鼠隊(duì)列。每籠飼養(yǎng)6只小鼠，分別飼養(yǎng)在混合基因型籠子(每個(gè)基因型3只，籠子1-4)或相同基因型籠子(同一基因型6只小鼠，籠子5-8)中(圖1A)。

為了分析腸道菌群，我們收集了移植到CF后1個(gè)月和10個(gè)月的所有小鼠的糞便顆粒。提取了DNA后，并對(duì)16S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增測(cè)序。對(duì)16S rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的分析不僅顯示了小鼠的聚集性(藍(lán)色的CF與紅色的SPF)，而且CF的微生物組成隨著時(shí)間的推移發(fā)生了巨大的變化，但SPF沒(méi)有變化(圖1B)。在兩種基因型(圖1C和D)的β多樣性結(jié)果中，根據(jù)動(dòng)物設(shè)施的類(lèi)型，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的、統(tǒng)計(jì)上顯著的差異(p=<0.005，PERMANOVA)。在接下來(lái)的9個(gè)月里，CF和SPF之間的差異變得更加顯著(圖1E和F)。在轉(zhuǎn)移到CF時(shí)，小鼠出生6周(從斷奶到成年)，小鼠腸道微生物群應(yīng)該是完全發(fā)育的，但仍然容易受到環(huán)境誘因引起的組成變化的影響。

圖1-1

我們通過(guò)獨(dú)立地將機(jī)器學(xué)習(xí)方法應(yīng)用于3983個(gè)ASV，進(jìn)一步將基因型分離ASV的集合細(xì)化到只有40個(gè)。ASV根據(jù)特征重要性進(jìn)行排序，由“隨機(jī)森林”算法確定，41個(gè)ASV用50%的樣本進(jìn)行訓(xùn)練，并在剩余50%的樣本上進(jìn)行測(cè)試。這40個(gè)ASV足以準(zhǔn)確(96.8%)預(yù)測(cè)小鼠基因型(圖1G)。事實(shí)上，這種機(jī)器學(xué)習(xí)工具能夠預(yù)測(cè)小鼠的基因型，這證實(shí)了Pax5雜合性形成了特定的腸道微生物群落。值得注意的是，16S rRNA全長(zhǎng)測(cè)序使我們僅使用5212個(gè)全長(zhǎng)ASV中的4個(gè)，就進(jìn)一步提高了Pax5+/-和WT動(dòng)物之間的基因型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確率達(dá)到100%(圖1H)。WT和Pax5+/-小鼠微生物群的主要區(qū)別在于Pax5+/-小鼠缺乏完整的共生菌。具體地說(shuō)，在WT小鼠中可以檢測(cè)到的Rikenellaceae、S24-7和Oscillospira屬的成員在CF的Pax5+/-小鼠的微生物群落中缺失(圖1I)。在SPF中，在Pax5+/-小鼠的微生物群落中沒(méi)有檢測(cè)到Rikenellaceae和Oscillospira屬的成員(圖1J)。

圖1-2

Sca1-ETV6-RUNX1小鼠在SPF組10個(gè)月時(shí)和CF組3~4個(gè)月時(shí)進(jìn)行微生物群分析。將這些數(shù)據(jù)與我們之前的分析相結(jié)合，證實(shí)了環(huán)境(設(shè)備)和基因型是形成腸道微生物群的關(guān)鍵因素(圖2A，B)。SourceTracker2分析表明，Pax5+/-微生物來(lái)源在Sca1-ETV6-RUNX1微生物群的組成中也很突出(圖2C)，PERMANOVA分析結(jié)果證實(shí)，所分析的基因型形成的微生物群有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(圖2D)。使用10個(gè)最重要的ASV(有1000棵樹(shù)的隨機(jī)森林)，可以通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)易感基因型(圖2E)。這些分析證實(shí)，在遺傳上易患PB-ALL的基因型都有不同的微生物群，獨(dú)立于外圍的B細(xì)胞有缺陷。

?圖2

我們?cè)O(shè)立了第二個(gè)小鼠隊(duì)列，命名為“ABX”，并用抗生素治療這些小鼠以清除細(xì)菌。這個(gè)隊(duì)列由27只Pax5+/-和18只WT小鼠組成，我們?cè)谵D(zhuǎn)移時(shí)(在服用抗生素之前)、抗生素治療后4周和8周收集糞便顆粒，然后每?jī)芍苁占淮?，直到一只小鼠出現(xiàn)明顯的PB-ALL癥狀或達(dá)到其自然壽命的終點(diǎn)。通過(guò)微生物分析、糞便DNA濃度分析和16S rRNA擴(kuò)增序列測(cè)定(圖S7)，證實(shí)了抗生素雞尾酒的殺菌效果。在抗生素治療期間從小鼠身上收集的糞便樣本主要包含來(lái)自它們植物性飲食的Read(平均82%的Read可以歸類(lèi)為葉綠體或線粒體來(lái)源)。當(dāng)我們分析抗生素治療對(duì)不同器官造血室的影響時(shí)，我們觀察到抗生素治療并不改變WT或Pax5+/-小鼠的B細(xì)胞發(fā)育。然而，在抗生素治療后，我們觀察到Pax5+/-小鼠外周血中成熟B細(xì)胞的減少，但未觀察到WT小鼠中成熟B細(xì)胞的減少。

圖S7

我們觀察到，在抗生素治療后通過(guò)細(xì)菌耗盡來(lái)改變微生物群并沒(méi)有改變Peyer氏斑中B細(xì)胞的數(shù)量，但與未治療的Pax5+/-小鼠相比，接受抗生素治療的Pax5+/-小鼠的CD3+-T細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖S25)。CD3+-T細(xì)胞的減少與抗癌免疫力的降低有關(guān)。因此，我們想知道T細(xì)胞數(shù)量的減少是否與接受抗生素治療的Pax5+/-小鼠的PB-ALL發(fā)展有關(guān)。我們將Pax5+/-小鼠與缺乏nu/nu小鼠的胸腺缺陷T細(xì)胞雜交。33只Pax5+/-；nu/nu小鼠中有5只(15%)觀察到PB-ALL發(fā)育，而WT；nu/nu對(duì)照組小鼠(n=31)均未觀察到PB-ALL發(fā)育。

圖S25

我們考慮了在SPF條件下腸道生理性微生物群的作用，以及在沒(méi)有自然感染誘因的情況下，通過(guò)細(xì)菌枯竭來(lái)改變它是否會(huì)導(dǎo)致白血病的發(fā)生。為了測(cè)試這一點(diǎn)，另外一組出生在SPF的23只Pax5+/-小鼠沒(méi)有被轉(zhuǎn)移到CF，而是在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一直保持在SPF中。這些小鼠接受抗生素治療。

在23只小鼠中，11只(47.82%)在11.4到20.7月齡之間出現(xiàn)了PB-ALL，而SPF中未經(jīng)治療的Pax5+/-小鼠(n=12)沒(méi)有發(fā)生白血病(圖4A-D)。這些白血病在表型、組織學(xué)、克隆性和遺傳學(xué)特征上與暴露于自然感染的Pax5+/-小鼠中出現(xiàn)的白血病相似。這表明，完整的微生物群可以保護(hù)遺傳易感的小鼠免受白血病的侵襲，即使在沒(méi)有感染環(huán)境的情況下，通過(guò)抗生素治療后的細(xì)菌枯竭來(lái)改變微生物群也可能引發(fā)白血病。

?圖4

我們首先證實(shí)，抗生素治療后的微生物群落以一種依賴(lài)于基因型的方式再生，并且能夠隨著時(shí)間的推移而重建(圖5A)。接下來(lái)，我們將Pax5+/-發(fā)展為PB-ALL的小鼠的腸道微生物群與在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持健康的小鼠的腸道微生物群進(jìn)行了比較。通過(guò)對(duì)所有時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用離散FDR，我們確定了3983個(gè)已鑒定的V4-ASV中的42個(gè)在白血病前期Pax5+/-小鼠(n=144，糞便樣本)和健康Pax5+/-小鼠(n=164，糞便樣本)之間差異豐富(圖5B，C)。這些發(fā)現(xiàn)將遺傳易感性和耗盡的微生物群與那些將患上感染驅(qū)動(dòng)的PB-ALL的Pax5+/-小鼠聯(lián)系在一起。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明腸道微生物群有可能被用作早期生物標(biāo)記物來(lái)識(shí)別易患白血病的遺傳易感小鼠。

圖5

接下來(lái)，我們調(diào)查了小鼠血清中的代謝體成分是否能幫助我們識(shí)別遺傳性PB-ALL的易感性。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們用GC-MS分析了SPF飼養(yǎng)的WT(n=10)和Pax5+/-(n=10白血病前期，n=10白血病)小鼠的代謝組(圖6A)。PCoA表示按基因型和健康狀況進(jìn)行聚類(lèi)(圖6B)。我們發(fā)現(xiàn)52種化合物中有6種在WT和白血病前期Pax5+/-小鼠之間差異顯著(圖6C)。與白血病Pax5+/-小鼠血清樣本相比，健康的白血病前期Pax5+/-小鼠血清樣本中有16種化合物含量顯著不同(圖6D顯示了前6種化合物)。

圖6

總而言之，健康、白血病前期或白血病代謝組是不同的，并由幾個(gè)因素定義(圖7)，而不是單一的特定代謝物或細(xì)菌種類(lèi)。

圖7